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目的缺血性脑卒中是一种严重损害神经功能的疾病,其具有很高的发病率和死亡率。缺血性脑损伤后期的神经再生与修复是脑卒中治疗的关键环节。脑卒中后可以诱发内源性神经干细胞增殖、分化并向损伤区域迁移,其中多条信号通路参与调节神经干细胞的活动。通过调节特异性的分子机制,可以增强脑损伤诱导的内源性神经干细胞的增殖与分化过程。目前,参与调节神经干细胞增殖与分化的经典信号通路有四条,即Wnt信号通路、Notch信号通路、Shh(Sonic Hedgehog,Shh)信号通路与骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号通路。在前期我们研究Wnt信号通路时发现,β-catenin做为Wnt信号通路的关键调节因子,同时也是Eph信号通路的下游蛋白之一。因此,我们关注到了Eph/ephrin这条信号通路。Eph受体是具有最多成员的受体酪氨酸激酶家族,其与配体ephrin结合后可以诱发双向传导过程。近年来研究表明Eph受体与ephrin配体参与调节神经干细胞的增殖、分化、存活与迁移活动。但对于EphB4的研究都集中在肿瘤方面,其对神经干细胞的调节作用却未见报道。而肿瘤细胞中存在少部分肿瘤激活细胞,这些细胞与干细胞有着共同的特性,肿瘤可以从正常组织干细胞转化而来。我们猜想EphB4是否在神经干细胞的增殖与分化方面也起到重要作用。本实验旨在研究EphB4是否参与调节了人胚胎神经干细胞的增殖、分化、凋亡活动,并探索其下游信号通路与调节机制,为脑卒中治疗提供新的靶点。方法(1)人胚胎神经干细胞的鉴定:培养原代人胚胎神经干细胞,正常培养3天后进行Nestin免疫荧光染色标记巢蛋白;分化培养10天后进行βⅢ-tubulin与胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光染色分别标记神经元与星形胶质细胞;分化培养16天后进行半乳糖脑苷脂(galactocerebroside,Galc)免疫荧光染色标记少突胶质细胞,进行人胚胎神经干细胞鉴定。(2)EphB4信号通路的机制研究:培养原代人胚胎神经干细胞,使用沉默慢病毒与过表达慢病毒转染细胞,分别下调和上调EphB4基因水平及其蛋白表达水平,分为EphB4基因沉默对照组(Scrambled-sh RNA)、EphB4基因沉默组(EphB4-sh RNA)、EphB4基因过表达对照组(EphB4-control)、EphB4基因过表达组(EphB4-OE)。然后通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测EphB4的基因表达水平,Western blot检测EphB4的蛋白表达水平来确定沉默及过表达效率。通过克隆分析、Brd U免疫荧光染色观察EphB4对细胞自我更新与增殖的影响;通过Dcx、βⅢ-tubulin、GFAP、NG2免疫荧光染色及RT-PCR检测Dcx、βⅢ-tubulin、GFAP、NG2基因水平,Western blot检测Mash1蛋白表达水平观察EphB4对人胚胎神经干细胞分化的影响;通过Cleaved-caspase3、caspase8免疫荧光染色,Western blot检测活性caspase8的表达水平、AnnexinⅤ-PE/7-AAD流式试剂盒分析观察EphB4对人胚胎神经干细胞凋亡的影响;通过细胞周期分析及使用Cyclin D1/CDK4抑制剂FAS、Abl抑制剂Gleevec、Abl激动剂DPH抑制和激活蛋白表达水平探索EphB4下游信号通路。结果(1)我们培养的人胚胎神经干细胞,Nestin~+细胞的比例为77.37%,并且可以成功分化为βⅢ-tubulin~+神经元、GFAP~+星形胶质细胞与Galc~+少突胶质细胞。(2)与对照组相比,转染EphB4沉默慢病毒可以显著降低EphB4的m RNA水平与蛋白表达水平,转染EphB4过表达慢病毒可以显著提高EphB4的m RNA水平与蛋白表达水平,人胚胎神经干细胞EphB4基因沉默及过表达模型成功建立。(3)克隆分析与免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,EphB4基因沉默显著降低了神经球直径、神经球个数与Brd U阳性细胞数,抑制了细胞增殖;EphB4过表达显著增加了神经球的直径、神经球个数与Brd U阳性细胞数,促进了细胞增殖。(4)免疫荧光染色、RT-PCR分析与Western blot结果显示,与对照组相比,EphB4基因沉默显著降低了Dcx、βⅢ-tubulin阳性细胞数及其m RNA水平、Mash1蛋白表达水平,显著增加了GFAP、NG2阳性细胞数及其m RNA水平,抑制细胞向神经元分化,促进细胞向胶质细胞分化;EphB4基因过表达显著增加了Dcx、βⅢ-tubulin阳性细胞数及其m RNA水平、Mash1蛋白表达水平,显著降低了GFAP、NG2阳性细胞数及其m RNA水平,促进细胞向神经元分化,抑制细胞向胶质细胞分化。(5)免疫荧光染色、Western blot及细胞流式结果显示,与对照组相比,EphB4沉默组与过表达组Cleaved-caspase3、caspase8阳性细胞数、活性caspase8蛋白表达水平及AnnexinⅤ-PE~+/7-AAD-标记的细胞数量无显著变化,EphB4基因沉默及过表达对细胞凋亡无影响。(6)细胞周期检测结果显示,与对照组相比,EphB4基因沉默可以显著增加G0/G1期细胞数量,相对的减少S期与G2/M期的细胞数量;EphB4基因过表达可以显著减少G0/G1期细胞数量,相对的增加S期与G2/M期的细胞数量。EphB4基因沉默及过表达可以影响G1期调节蛋白Cyclin D1、CDK4的表达水平,使用Cyclin D1/CDK4抑制剂FAS抑制蛋白活性后消除了EphB4过表达促进细胞增殖的作用。结果表明Cyclin D1/CDK4介导了EphB4蛋白对人胚胎神经干细胞增殖的调节作用。(7)Western blot结果显示,EphB4基因沉默及过表达可以影响Abl的表达水平,使用Abl抑制剂Gleevec与激动剂DPH抑制与激活Abl蛋白可以影响Cyclin D1、CDK4的表达水平,并且在Abl蛋白活性被抑制后可以消除EphB4过表达促进细胞增殖的作用。结果表明,Abl作为EphB4的下游蛋白介导了EphB4调控Cyclin D1/CDK4影响细胞增殖的作用。(8)使用Abl抑制剂Gleevec与Cyclin D1/CDK4抑制剂FAS抑制蛋白活性并未影响EphB4过表达促进细胞向神经元方向分化,抑制细胞向胶质细胞分化的作用。结果表明,Abl-Cyclin D1/CDK4信号通路并未参与调节EphB4对细胞分化的作用。结论:EphB4基因沉默后,抑制体外培养人胚胎神经干细胞的增殖及细胞向神经元分化,促进细胞向胶质细胞分化,对细胞凋亡无影响。EphB4基因过表达后,促进体外培养人胚胎神经干细胞的增殖及细胞向神经元的分化,抑制细胞向胶质细胞分化,对细胞凋亡无影响。EphB4是通过下游信号通路Abl-Cyclin D1调节细胞增殖,此信号通路不参与EphB4在细胞分化方面的调节。EphB4参与调节神经干细胞增殖,而且是决定神经干细胞向神经元分化还是向胶质细胞分化的开关,其很可能成为脑损伤后神经元修复的有效治疗靶点。