一.前言骨骼的发生可分为四期:(1)胚胎细胞向骨骼生成部位迁移期;(2)上皮细胞-间充质细胞相互作用期;(3)致密体(condensations)形成期;(4)成软骨细胞(chondroblasts)和成骨细胞(osteoblasts)增殖与分化期。骨骼的发生有两种方式:(1)由软骨板起源发育成骨骼的过程称为软骨内成骨(endochondral ossification),其过程十分复杂,包括多个成骨步骤。软骨内成骨不但生成骨骼,而且还是出生后个体骨构塑(bone molding)和骨折修复的重要方式之一。(2)膜内成骨(intramembranous osteogenesis)与之不同,其成骨过程无软骨胚基(cartilaginous blastema)的参与,直接由骨化中心的间充质细胞致密化并转型成为成骨细胞而形成骨组织。自胚胎第7周以后开始出现膜内成骨和软骨内成骨,膜内成骨见于额骨、顶骨、颞骨、锁骨等扁骨和不规则骨。骨骼发育完全后,骨组织具有特定的结构。骨组织结构是为其功能服务的,骨结构与功能之间存在着紧密联系。不论是骨的整体构型与形态,还是骨的内部微结构,它们都是执行骨的功能的结构基础。从小的负重骨到四肢长骨,骨的形状和大小都不相同。这种钙化的骨组织在正常情况下被包裹在纤维鞘(即骨膜)内,具有丰富的神经和血液供应。但是,骨不是一种静止的钙化组织,而是一种动力结构(dynamic structure)组织。这种结构的成分和整个结构的设计,要经过骨组织细胞的持续活动,构造或改建出骨的微结构。骨组织结构形成后,骨质仍在进行骨形成与骨吸收而不改变骨的形态与大小的骨更新和骨代谢,以维持骨的相对稳定状态。这种在骨的同一部位少量骨质发生的一种循环性代谢过程称为骨重建。骨重建表现为骨组织细胞的增殖、分化、凋亡和转型。骨重建一般无骨形态变化,而仅表现为骨量的增加或减少,其是一种循环性代谢方式,。从微观层面来看,骨重建的基本单位是骨重建单位(bone remodeling unit,BRU)。骨重建的基本过程是:骨吸收(Bone Resorption)——骨形成(Bone Formation)——骨静止(Resting)——骨吸收(Bone Resorption),如此周而复始地循环着。骨自形成以后,其密度、形状及内部结构都在不断地进行调整与更新,在此过程中,骨组织细胞及骨内的血管组织起重要的作用。破骨细胞是骨吸收过程中起主要作用的细胞。骨稳态的维持有赖于骨吸收与骨形成之间的平衡。绝经期后骨质疏松患者骨吸收能力大于骨形成,从而导致骨丢失;多发性骨髓瘤晚期,仅有骨吸收而无骨重建。骨细胞占骨组织功能细胞总数的95%左右,位于由骨基质包裹而形成的陷窝内。虽然目前大多数对骨组织中钙转运的研究集中在成骨细胞和破骨细胞上,但是从骨组织中细胞的分布来分析,作者就可推测出占骨组织中细胞总数95%的骨细胞在维持钙的转运过程中所起的潜在作用。成骨细胞是骨形成的主要作用细胞。骨胶原及骨基质大部分由成骨细胞分泌,除此之外,成骨细胞还能分泌一些重要的细胞因子和酶类,如碱性磷酸酶(ALP),基质金属蛋白酶(MMPs),骨钙素(OCN),骨保护素(OPG),RANGKL等,从而调控骨代谢的进程。血管为骨代谢的发生带来氧分,营养及各种相应的调控因子,带走骨组织内的代谢产物(如二氧化碳、酸类等)。骨组织血流量占心脏血流量的l 0%,这为骨组织细胞的更新、骨重建及修复提供了巨大的便利。骨稳态失衡导致骨结构与功能性疾病发生。随着人口老龄化程度加重,骨质疏松及其伴发的骨折发病率逐年升高,已成为人类健康的一大杀手。目前主要依靠靶向破骨细胞的抗骨吸收类药物来治疗骨质疏松,长期应用这类药物,会导致骨更新受抑制而骨内的微损伤逐日累积,结果造成骨质变脆、生物力学性能下降、易发骨折。因此,临床上对于靶向成骨细胞促进骨形成的药物有现实需求,而这类药物的研发则有赖于成骨细胞及骨代谢的基础研究。目前认为,通过调节成骨细胞的增殖、分化及延长其生存时间可促进骨形成。成骨细胞的分化过程通常分为3个阶段:(1)间充质干细胞(mesenchymal progenitors),(2)成骨细胞前体(preosteoblasts),(3)成熟成骨细胞。成骨细胞分化过程中,依赖于许多特异的转录因子的调节,如SOX9,RUNX2,OSX,ATF4等。这些转录因子作用于分化过程中的不同时相,因此它们同时也决定了成骨谱系细胞的发育阶段。此外,成骨细胞的分化还依赖于各种信号通路的网络状调控,这些信号通路可通过控制转录因子的表达及活性调控成骨细胞的分化。在这些信号通路中,mTORC1信号通路是整合细胞内外各种信号,调节细胞生长与代谢的中心信号分子,参与调节细胞的增殖、分化、存活及凋亡等。mTORC1信号通路对骨骼发育及骨代谢的重要作用已被科学界所公认。然而,众多的相关研究结果均不一致甚至相互矛盾,且相应的机制也均未得到阐明。调控骨内血管生成是治疗骨结构与功能性伤、病的另一重要靶标。众所周知,骨折修复过程中,骨折端的血液供应是影响骨折愈合速率的一个至关重要的因素。且最近发现,骨质疏松症的发病也与骨内血管数量的减少直接相关。骨是一种高度异化和血管化的组织,其内各种细胞彼此通讯交流,这种细胞间的“对话”对骨发育与骨稳态的维持至关重要。成骨细胞作为骨质中最主要的细胞,其与骨内“营养供应管道的组成细胞”(血管内皮细胞)之间的“对话”也越来越受到科学界的重视。近年来研究发现,成骨细胞能分泌一些血管生成因子(血管内皮细胞生成因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、促红细胞生成素(erythropoietin,EPO等,从而调节骨内血管的生成。然而,至今已被发现的这些由成骨细胞表达分泌的血管生成因子数量是十分有限的,且这些因子在成骨细胞内表达和分泌的调控机理也是基本未知的。因此,还需要有更多的研究来阐释。二.目的损伤或年龄相关的退行性改变,会严重破坏骨的结构与功能。骨结构与功能相关伤、病(如骨折,骨质疏松等)不仅严重影响患者的生活质量,而且给国家、社会、家庭带来了沉重的经济负担,因而探究骨结构修复的新疗法意义重大。众所周知,通过靶向成骨细胞促进骨形成能加速骨结构与功能性伤、病的修复;另外,调控骨内血管生成也是治疗骨结构与功能相关疾病的重要靶标,因为在骨折修复过程中,骨折端的血液供应是影响骨折愈合速率的一个至关重要的因素;且最近发现,骨质疏松症的发病也与骨内血管数量的减少直接相关。mTORC1信号通路具有广泛的生物学效应,但是其在成骨细胞及骨稳态维持中的功能还缺乏足够的证据。本研究拟从两方面考察成骨细胞内mTORC1对骨结构与功能稳态维持的作用:(1)对骨形成的作用;(2)对骨内血管形成的影响。为此,本项目拟通过利用成骨细胞特异性敲除Tsc1(mTORC1过度激活)、Raptor(mTORC1被抑制)基因的小鼠、上述基因敲除的成骨细胞以及血管内皮细胞等模型,在分子、细胞、细胞间乃至动物整体水平研究成骨细胞内mTORC1信号在调控骨形成及骨内血管形成中的作用,探讨其细胞与分子机制,以期为骨形成及骨内血管形成的调控增加新内容,为今后骨结构与功能性伤、病(骨折、骨质疏松等)的临床治疗提供新的理论支撑。三.材料和方法1、成骨细胞内mTORC1对骨形成的作用研究在成骨细胞系MC3T3-E1及原代成骨细胞的体外增殖、分化及矿化过程中,提取各阶段的细胞蛋白,通过Western blot检测mTORC1信号通路活性的变化,初步了解成骨细胞增殖与分化过程中对mTORC1信号的需求。在此基础上,分别利用雷帕霉素(mTORC1特异性抑制剂)及成骨细胞内特异性敲除Tsc1(致mTORC1激活)的小鼠及细胞模型,在体内外分别检测mTORC1失活及激活后对成骨细胞增殖、分化及矿化的影响。在动物体内水平检测过程中,作者先利用测量小鼠体重、观察动物体格的外观、X线、micro-CT检测分析等方法从整体水平检测成骨细胞内mTORC1失活及激活后对小鼠骨骼骨质形成的大体影响;随后,作者对相应动物模型的下肢骨取材,用扫描电镜观察模型小鼠骨内原位成骨细胞形态学上的变化。作者制作冰冻切片、石蜡切片及塑料切片,利用HE染色显示小鼠骨组织一般结构的变化;利用不脱钙的骨组织塑料切片及相应骨组织的特殊染色(Goldner’s-Masson trichrome染色)显示骨组织特殊结构的变化(如类骨质形成、骨质矿化的改变等);利用骨组织细胞的特异性染色,如ALP染色,TRAP染色,成骨细胞特异性标记物的免疫组化染色等观察相应动物模型骨内成骨细胞数量及标记物表达水平的改变,以观察模型小鼠体内成骨细胞在细胞及分子水平的改变。为了在体外验证体内实验的结果,作者取新生小鼠原代成骨细胞在体外培养扩增。作者利用Brdu掺入法及细胞免疫荧光检测成骨细胞增殖的变化;为扣除细胞增殖对细胞成骨能力的影响,作者对接触抑制的细胞进行成骨诱导及mTORC1活性干预处理,利用Western blot检测不同时间点细胞表达成骨细胞特异性标记物的变化,利用茜素红染色观察成骨细胞矿化能力的改变。作者同时对mTORC1调控成骨细胞骨形成的机理做了详细的研究。作者对mTORC1失活及激活的骨组织及成骨细胞行蛋白水平的Western blot检测,发现在成骨细胞内mTORC1可以正调控Notch信号通路;通过免疫共沉淀(CoIP)、mTOR 的体外激酶实验(Kinase assay),发现 mTORC1可促进 STAT3(Ser727)的磷酸化激活;用成骨细胞模型的核蛋白与P63探针在体外行凝胶电泳迁移变动实验(EMSA),发现mTORC1可促进STAT3与其靶基因P63启动子的结合并促进P63的转录;利用RNA干扰技术,作者发现mTORC1通过P63促进Notch配体Jaggedl的表达乃至激活整个Notch通路。通过Notch干扰RNA及其抑制剂DAPT处理相应小鼠及细胞模型后,作者发现正是Notch通路介导了 mTORC1对成骨细胞分化的调控作用,而且Notch抑制成骨细胞分化的机制则是抑制成骨细胞内Runx2的表达。2、成骨细胞内mTORC1对骨内血管生成作用的研究为检测成骨细胞内mTORC1对骨内血管生成的影响,作者首先分别构建了成骨细胞内特异性敲除Tsc1(致mTORC1激活)及Raptor(mTORC1失活)的小鼠。通过观察小鼠骨骼的外观色泽,形成对相应小鼠骨内血液充盈的初步印象。然后,作者对小鼠长骨行切片,通过血管特异性标记物CD31的免疫组化染色,定量分析小鼠骨内血管数量的变化。为了在体外验证体内实验的结果,作者取小鼠头盖骨细胞培养上清,用其培养血管内皮细胞系HUVEC,利用Brdu掺入及细胞免疫荧光方法检测内皮细胞增殖的改变;利用划痕实验检测内皮细胞迁移的变化;利用基于基质胶的血管内皮细胞体外成管实验检测成骨细胞培养基对血管内皮细胞体外成管的直接作用。为探索成骨细胞内mTORC1调控骨内血管形成的机制,作者利用免疫荧光双标实验及ELISA检测成骨细胞内VEGF的表达与分泌的情况,并对在成骨细胞培养上清中培养的内皮细胞用Western blot检测其胞内VEGF信号的传导情况。而检测结果发现:mTORC1正调控成骨细胞内VEGF的表达和分泌,但这并不是导致相应小鼠及细胞模型血管生成改变的原因。为进一步探索介导mTORC1调控骨内血管生成的机制,作者利用全基因组表达谱芯片筛选受mTORC1的血管生成(抑制)因子。从中筛选到了 Cxcl9,其从理论上可以解释相应血管形成的改变。为确定Cxcl9是否介导了 mTORC1调控血管形成的过程,作者在体内外进行了验证。通过对成骨细胞行原位杂交及Western blot实验,作者发现成骨细胞能特异性表达Cxcl9。通过荧光定量PCR及Western blot检测,作者发现mTORC1可在转录水平促进Cxcl9的表达。对相应小鼠及细胞模型给予外源性的Cxcl9蛋白或Cxcl9抗体去除Cxcl9的影响后,作者发现相应模型的血管生成接近正常化,从而确定Cxcl9的改变确实是mTORC1调控骨内血管生成的原因。随后,作者探索mTORC1调控Cxcl9的机制。因转录因子STAT1能调控Cxcl9的表达;作者通过细胞的STAT1免疫荧光染色,作者发现mTORC1促进STAT1核转位。利用凝胶电泳迁移变动实验(EMSA),作者发现成骨细胞内STAT1能与Cxcl9的启动子特异性结合,且mTORC1能促进这种结合。最后,作者通过使用STAT1的干扰RNA敲低STAT1其在成骨细胞内的mRNA量,确定其在介导mTORC1调控Cxcl9表达过程中的作用。为了探索成骨细胞内Cxcl9与绝经期后骨质疏松的相关性,作者构建了卵巢切除小鼠模型。通过micro-CT观察其骨参数变化,确定模型建立是否成功。随后作者利用血管免疫组化染色检测其骨内血管数量的改变;利用ELISA检测小鼠髓腔及血清内Cxc19的浓度,确认小鼠骨内Cxcl9浓度与骨内血管数量之间的相关性。最后,对模型小鼠给于Cxcl9的抗体,检测小鼠体内Cxcl9浓度的减低是否会导致血管形成乃至骨质疏松症状的改变。四.结果1、成骨细胞内mTORC1对骨形成的作用研究成骨细胞增殖过程中,mTORC1活性与其增殖速率呈正相关;成骨细胞分化过程中,mTORC1活性与其分化程度呈负相关。雷帕霉素(mTORC1特异性抑制剂)在体内外均能抑制成骨细胞的增殖。小鼠经雷帕霉素腹腔注射后,其骨量形成明显减少,骨内成骨细胞数量减少,但是单个成骨细胞表达成骨标记物Osx和Ocn均增加。成骨细胞内mTORC1特异性激活的小鼠体内产生大量不成熟的编织骨,其成骨细胞增殖加快而分化则被抑制,成骨细胞数量增加,而单个成骨细胞标记物OSX及OCN表达均减少,骨基质矿化能力减弱导致骨组织内大量类骨质堆积。机制研究表明:mTORC1促进STAT3(S727)的磷酸化,后者促进p63基因的转录,p63又能升高Notch配体Jagged1的表达乃至增加Notch通路的活性。Notch激活后能抑制成骨细胞内Runx2的表达,进而抑制成骨细胞分化。2、成骨细胞内mTORC1对骨内血管生成作用的研究成骨细胞内mTORC1激活的小鼠,其骨内血管形成减少。体外实验中,mTORC1激活的成骨细胞上清抑制成骨细胞的增殖、迁移及小管结构形成。反之,成骨细胞内mTORC1失活的小鼠骨内血管形成增加,mTORC1失活的成骨细胞能促进成骨细胞的增殖、迁移及小管形成。mTORC1激活的成骨细胞,其表达和分泌的血管内皮细胞生长因子VEGF的量增加,这种细胞的上清却使在其中培养的内皮细胞内VEGF信号的传递受阻;与此相反,mTORC1失活的成骨细胞表达和分泌VEGF减少,而其上清却能促进内皮细胞内VEGF信号通路的活化。全基因组表达谱芯片筛选结果发现,mTORC1激活的成骨细胞Cxcl9 mRNA水平明显上调。mTORC1激活的成骨细胞培养上清内Cxcl9被加入的抗体中和后,其抑制内皮细胞增殖、迁移及成管的作用明显被逆转,其反而能促进内皮细胞的增殖、迁移及体外成管。反之,mTORC1失活的成骨细胞培养上清内加入外源性Cxcl9蛋白后,其促进内皮细胞增殖、迁移及成管的作用也明显被逆转—反而抑制其增殖、迁移及体外成管。机制研究发现,mTORC1激活能明显上调STAT1 mRNA及蛋白水平。细胞免疫荧光染色结果显示:mTORC1活化的成骨细胞内,其STAT1主要定位于细胞核内;反之,mTORC1失活的成骨细胞内的STAT1主要定位于细胞质。mTORC1激活的成骨细胞,其核蛋白内STAT1与Cxc19启动子有更多的结合;反之,mTORC1失活的成骨细胞,其STAT1与Cxcl9启动子结合减少。绝经后骨质疏松的小鼠,其骨内血管数量明显减少。ELISA检测结果发现,其骨髓及血清Cxc19浓度升高。小鼠给予腹腔Cxcl9抗体注射后,其骨内血管形成明显增加,而且其骨量也随之增加。五.结论1、成骨细胞内mTORC1对骨形成的作用研究(1)成骨细胞增殖需要高活性mTORC1,而其分化则需要低活性mTORC1。(2)mTORC1失活抑制成骨细胞增殖而促进其分化;相反,mTORC1活化促进其增殖而抑制其分化(3)成骨细胞内mTORC1可通过STAT3/P63激活Notch信号通路,后者通过抑制成骨细胞内Runx2的表达而抑制其成骨分化。(4)骨形成过程中,成骨细胞对mTORC1活性的需求呈现阶段依赖性。因此阶段性调控成骨细胞内mTORC1活性可能有助于骨形成。2、成骨细胞内mTORC1对骨内血管生成作用的研究(1)成骨细胞内mTORC1活化抑制骨内血管形成;反之,成骨细胞mTORC1失活促进骨内血管形成。(2)mTORC1正调控成骨细胞内VEGF的表达和分泌,对骨内血管形成发挥调控作用。(3)成骨细胞可表达、分泌Cxcl9,后者通过阻断VEGF信号的转导而抑制骨内血管形成。(4)mTORC1通过调控STAT1的表达及其核转位而调控Cxcl9的表达和分泌。(5)绝经期后骨质疏松小鼠体内Cxcl9含量增加,后者与小鼠骨内血管形成及骨量的减少紧密相关;减少骨质疏松小鼠体内Cxcl9含量可增加其骨内血管数量,进而促进其骨形成。mTORC1/Cxcl9有望成为治疗绝经期后骨质疏松的新靶标。