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目的：肝性脑病(hepatic encephalopathy, HE)是严重危害人类健康的疾病,有关其发病机制尚未完全明确。众所周知,HE病人血液中内毒素、肿瘤坏死因子升高,这两者均是一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的促进剂。NOS被激活,促进一氧化氮(nitric oxide, NO)的合成,使体内NO大量增加,而且由于抗氧化防御能力下降,体内超氧阴离子自由基(superoxide anion,O2-·)也常见升高。NO与O2-·会迅速反应生成过氧亚硝酸阴离子(peroxynitrite, ONOO-),该反应几乎不可逆,因而HE病人体内ONOO可能异常增高。由于异常增高的ONOO可特异性使蛋白质酪氨酸(tyrosine, Tyr)线基硝基化而直接影响到蛋白质的功能；可使神经元细胞膜氧化从而导致神经传导功能障碍；可能造成肝、脑细胞线粒体破坏及能量合成障碍等,所以,在HE发病过程中,ONOO的作用不能排除。因此本研究通过对临床肝损伤病人及大鼠HE模型血清氧化／硝基化指标的检测,探讨ONOO在HE的发生发展中的作用,揭示ONOO-的致病机制,为HE病因的研究及其治疗提供新的思路和科学依据。研究方法：1.对临床肝损伤病人的研究1.1研究对象的选取与分组选取同一时期根据卫生部病毒性肝炎诊断标准明确诊断的病毒性肝炎伴HE患者45例和病毒性肝炎非HE患者30例以及同一时期的健康查体者30例,根据疾病严重程度将其分为3组：病毒性肝炎伴HE组,病毒性肝炎非HE组,健康对照组。HE的诊断：病毒性肝炎患者除肝功能严重损伤外,临床上出现一系列无其他原因可解释的神经精神症状,并按下列条件分期：Ⅰ期：前驱期,Ⅱ期：昏迷前期,Ⅲ期：昏睡期,Ⅳ期：昏迷期。1.2各种生化指标的测定空腹采血,离心分离后取血清。用高效液相色谱-荧光检测法检测血清中3-硝基酪氨酸(3-NT)含量；硫代巴比妥酸法检测血清中丙二醛(MDA)含量；黄嘌呤氧化物酶法检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)的活力。2.对大鼠HE模型的研究2.1.大鼠HE模型的建立及分组用硫代乙酰胺(Thioacetamide, TAA)建立大鼠HE模型。雄性Wistar大鼠随机分为4组(每组15只)：空白对照组(Ⅰ)、HE模型组(Ⅱ)、依布硒啉处理组(Ⅲ)、溶剂对照组(Ⅳ)。除Ⅰ组外,其它各组第1 d均腹腔注射TAA 300 mg/kg,第2-4 d,每日分别注射TAA 150 mg/kg,直至出现HE症状；Ⅰ组给予等量生理盐水腹腔注射。TAA处理组出现HE症状后,Ⅲ组每天经口灌胃依布硒啉1 mL/100g,Ⅰ组和Ⅱ组灌胃等量生理盐水,Ⅳ组灌胃等量0.5%二甲基亚砜(DMSO)。2.2.各种生化指标的测定各组大鼠于TAA处理前断尾法取血；采用TAA处理后,TAA处理组大鼠出现Ⅱ期HE症状时,各组大鼠断尾取血；灌胃处理后,在Ⅱ组大鼠出现Ⅲ期或Ⅳ期HE症状后,各组大鼠均断头处死,取血。用高效液相色谱-荧光检测法检测血清中3-NT含量；赖氏法检测血清中ALT的活力；硫代巴比妥酸法检测血清中MDA含量；黄嘌呤氧化物酶法检测血清中SOD的活力。2.3.组织病理切片的制作及染色各组大鼠断头处死后取肝组织,制作石蜡切片,进行苏木素-伊红染色观察组织病理改变。结果：1.临床生化指标分析1.1 HE病人血清中3-NT、SOD和MDA的检测结果病毒性肝炎伴HE组病人血清生化指标与病毒性肝炎非HE组比较：病毒性肝炎伴HE组病人血清中3-NT的含量明显升高(P<0.01),SOD的活性显著降低(P<0.01),MDA的含量明显升高(P<0.01)。病毒性肝炎非HE组病人血清生化指标与健康对照组比较：病毒性肝炎非HE组病人血清中3-NT的含量显著升高(P<0.01),SOD活性明显降低(P<0.01),MDA的含量显著升高(P<0.01)。1.2不同时期HE病人血清中3-NT、SOD和MDA的检测结果病毒性肝炎伴HE组病人Ⅰ-Ⅱ期与Ⅲ-Ⅳ期血清中各生化指标的差异均具有显著性(P<0.01)。随HE病情加重,病人血清中3-NT的含量升高(P<0.01),SOD的活性降低(P<0.01),MDA的含量升高(P<0.01)。1.3 HE病人血清中3-NT和SOD、MDA的相关性分析HE病人血清中3-NT和SOD、3-NT和MDA之间存在明显相关性(P<0.05),其中3-NT含量和SOD活性呈负相关。2大鼠一般状态及解剖观察腹腔注射TAA 2 d后,即可出现HEⅠ期或Ⅱ期症状。根据每只大鼠的具体情况减量注射TAA后,在3-7 d内,可继续发展至Ⅲ期或Ⅳ期症状直至死亡。Ⅲ组大鼠在出现HE症状后灌胃依布硒啉,发现HE的发展速度减缓、症状减轻,存活时间延长。Ⅳ组大鼠在出现HE症状后灌胃DMSO,其病情进展基本同Ⅱ组。3大鼠血清生化指标分析3.1 HE大鼠血清生化指标的自身前后对照出现HE症状后,血清中3-NT的含量较造模前显著增加(P<0.01)；ALT的活性明显增高(P<0.01)；SOD的活性降低(P<0.05),MDA的含量显著增加(P<0.01)。3.2 HE大鼠与正常大鼠血清生化指标的比较出现HE症状后,Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组大鼠各血清指标与Ⅰ组相比：3-NT和MDA的含量均显著高于Ⅰ组(P<0.01)；ALT的活性明显高于Ⅰ组(P<0.01)；SOD的活性显著低于Ⅰ组(P<0.05),排除了饮食及腹腔注射刺激等因素对实验结果的影响。3.3药物处理后各组大鼠血清生化指标的比较药物处理后,Ⅱ组和Ⅳ组3-NT、ALT和MDA的含量显著高于Ⅰ组和ⅢⅡ组(P<0.01)；Ⅱ组和Ⅳ组、Ⅰ组和Ⅲ组之间各指标的差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅱ组和Ⅳ组SOD的活性显著低于Ⅰ组和Ⅲ组(P<0.01),Ⅱ组和Ⅳ组、Ⅰ组和Ⅲ组之间大鼠血清中SOD活性的差异不具有统计学意义(P>0.05)。3.4各组大鼠不同时期血清生化指标的比较Ⅰ组大鼠在不同HE时期血清生化指标的比较：Ⅰ组大鼠在各种处理前后各血清指标的变化均无统计学意义(P>0.05)；Ⅱ组和Ⅳ组大鼠在不同HE时期血清生化指标分析结果的比较：Ⅱ组和Ⅳ组大鼠在出现HE症状后血清中各生化指标的含量及活性与腹腔注射TAA前比较：3-NT和MDA的含量显著升高(P<0.01),ALT的活性显著增强(P<0.01),SOD的活性降低(P<0.05)；用药后血清各生化指标的含量及活性与用药前比较：3-NT和MDA的含量显著升高(P<0.01),ALT的活性明显增强(P<0.01),SOD的活性降低(P<0.05)；Ⅲ组大鼠在不同HE时期血清生化指标检测结果的比较：Ⅲ组大鼠出现HE症状后血清中各生化指标的含量及活性与腹腔注射TAA前相比：3-NT和MDA的含量显著升高(P<0.01),ALT的活性显著增强(P<0.01),SOD的活性降低(P<0.05)；用药后血清中各生化指标的含量及活性与用药前相比：3-NT和MDA的含量显著降低(P<0.01),ALT的活性明显降低(P<0.01),SOD的活性增强(P<0.05)。4.大鼠病理学观察结果Ⅱ组和Ⅳ组大鼠肝细胞有不同程度的坏死、崩解及消失,未坏死细胞也有严重变性,坏死组织中有较多的炎性细胞浸润。随HE分期越高,肝脏的病理改变越明显。Ⅲ组肝细胞形态与Ⅰ组相比,肝细胞体积增大,肝小叶结构未见明显改变。结论：本次实验从临床和动物实验两个方面,从生化和组织病理学角度初步探讨了ONOO在HE发病中的作用,ONOO的异常增多导致蛋白质硝基化可能是HE的发病机制之一,提示ONOO-的清除剂如依布硒啉等有益于控制病情。