硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)在各种蛋白聚糖中最具生物活性，参与细胞增殖分化、炎症反应、病原微生物感染以及抗凝血等多种生物进程。其生物活性受多种因素的影响，包括硫酸乙酰肝素残基上不同位点的硫酸化和异构体化，本研究对能够改变肝素多糖结构的各种修饰酶展开研究，为进一步探索HSPG的构效关系奠定了基础，而且对于开辟新的抗血栓，抗病毒，抗癌用药，具有十分重要的意义。本文主要研究内容如下：　　 以肝素黄杆菌为出发菌株，通过对GenenBank登录的肝素黄杆菌来源的2-O位脱硫酸基酶(2-O-sulfatase)与6-O位脱硫酸基酶(6-O-sulfatase)基因序列分析，设计并合成PCR引物，利用RT-PCR技术成功克隆了2-O-sulfatase与6-O-sulfatase成熟肽编码区，然后分别将其克隆到表达载体PET-28a(+)中，构建重组表达质粒PET-2S，PET-6S，转化大肠杆菌BL21(DE3)中，依次经过抗生素筛选，提取质粒PCR验证得到阳性克隆，然后通过测序确定了其正确性。　　 将所构建的2-O-sulfatase与6-O-sulfatase重组菌株，经IPTG低温诱导表达，由于质粒PET-28a(+)本身带有6×组氨酸标签，采用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱一步纯化，就可以得到纯度大于90％的重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测表明，2-O-sulfatase与6-O-sulfatase分别在49KD，61KD获得了可溶性表达。　　 Arixtra为肝素与凝血Xa因子结合部位的五糖衍生物，是最简单的抗栓药物，具有高选择抗FXa活性。采用前面所制备2-O-sulfatase与6-O-sulfatase的重组蛋白，分别对Arixtra进行2-O位与6-O位脱硫酸基团修饰，得到2-DeA，6-DeA，2，6-DeA，经过Bio-gel P2柱纯化后，进行抗FXa活性测定，结果显示脱掉硫酸基的Arixtra衍生物，其抗FXa活性明显降低，初步验证了2-O-sulfatase与6-O-sulfatase能够脱掉肝素寡糖结构上特定位点硫酸基团的活性。　　 将实验室保存的肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ重组质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建高效生产可溶性的肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的基因工程菌株。经IPTG低温诱导表达，分别在43KD，88KD，76KD获得了可溶性表达。以肝素钠为底物，通过A232法分别进行活性测定，均有良好的活性。　　 以肝素钠为底物，采用前面所表达的肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别对其进行酶解，通过改变所加酶的种类，其产物经过Bio-gel P6柱分级，结果显示所产生的寡糖片段比例各不相同，为精确分析肝素的结构和低分子量肝素的制备奠定了基础。