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研究背景:前期通过基因芯片技术和生物信息学相结合的方法研究发现miR-181a在慢性粒细胞白血病(CML)中有多个靶基因,经实验验证PPFIA1受miR-181a的直接调控,初步鉴定PPFIA1具有癌基因功能,但PPFIA1在CML中确切的分子作用机制尚不清楚。研究目的:本课题致力于探索PPFIA1对CML恶性进展的影响及其下游磷酸化信号分子和相互作用的蛋白鉴定,为白血病分子靶向治疗提供新的实验依据。研究方法:1.利用PPFIA1慢病毒颗粒构建稳定过表达PPFIA1蛋白的K562细胞;Western Blot验证K562细胞内PPFIA1表达水平;2.脂质体Lipofectamine TM 3000转染PPFIA-siRNA到K562细胞;3.Biotool Vita-Blue试剂检测PPFIA1对K562细胞药物敏感性的影响;4.甲基纤维素集落形成法检测PPFIA1对K562细胞增殖能力的影响;5.Transwell小室法检测PPFIA1对K562细胞侵袭能力的影响;6.磷酸化抗体芯片检测靶向抑制PPFIA1后K562细胞相应磷酸化蛋白表达水平的改变,并在K562和KCL-22细胞中使用Western Blot验证相关信号分子的改变;7.利用flag-PPFIA1慢病毒颗粒构建稳定表达flag-PPFIA1融合蛋白的K562细胞株,flag-BCR/ABL和myc-PARP1质粒构建稳定表达flag-BCR/ABL的293T细胞株;8.免疫沉淀(IP)flag-PPFIA1和flag-BCR/ABL融合蛋白,利用蛋白质质谱技术鉴定两组ip产物中的蛋白质组成。9.discoverystudio4.5client软件进行蛋白质结构的空间模拟对接,分别预测与ppfia1及bcr/abl蛋白直接作用的特异性蛋白,对免疫沉淀产物中的特异性蛋白质分子进行westernblot实验验证。10.parp1抑制剂olaparib处理k562-lentivppfia1后cck8检测药物敏感性及细胞克隆形成能力的变化。研究结果:1.westernblot检测病毒感染后k562-ppfia1lentiv比k562-emptylentiv细胞内的ppfia1蛋白表达水平明显升高;2.过表达ppfia1基因后降低了k562细胞对imatinib和dasatinib的药物敏感性,增强了k562细胞的colony形成和侵袭能力;3.靶向抑制ppfia1增强了k562细胞对imatinib的药物敏感性,减弱了k562细胞的colony形成和侵袭能力;4.磷酸化芯片显示,靶向抑制ppfia1蛋白磷酸化水平下降率高于20%的蛋白有28种。其中c-kit(tyr721)磷酸化水平下降最明显,达76%,westernblot结果显示ppfia1能激活c-kit、akt、erk1/2磷酸化信号通路,靶向抑制ppfia1可以降低其磷酸化信号水平。5.质谱鉴定flag-bcr/abl免疫沉淀产物有132种特异性蛋白,而flag-ppfia1免疫沉淀产物有42种,其中parp1和ncoa5是flag-ppfia1和flag-bcr/abl两个免疫沉淀产物中共同存在的蛋白质分子。6.空间模拟对接和免疫共沉淀(co-ip)结果显示ppfia1能和parp1相互直接结合。7.parp1抑制剂olaparib能显著减弱k562-lentivppfia1细胞的活力和colony形成能力。8.过表达ppfia1可以激活parp1/p65/c-kit的磷酸化表达水平,靶向抑制ppfia1和parp1均可抑制p65和c-kit的磷酸化表达水平。研究结论:1.PPFIA1在CML中具有癌基因功能,靶向抑制PPFIA1基因的表达可以抑制CML恶性进展。2.PPFIA1下游涉及C-KIT等28个磷酸化信号分子。3.PPFIA1能与PARP1蛋白结合,促进P65转录进而激活C-KIT磷酸化信号通路,增强CML恶性进展。