荧光探针技术自从在上个世纪发现以来,实现了飞速、蓬勃的发展。相较于传统的检测方法,荧光探针具有操作简单、选择性好、敏感度高、毒性小、可以实时监控,并且操作简单等特点。目前,荧光探针检测技术作为一种高效的分析技术受到越来越多的科研人员的关注。时至今日,己有大量报道荧光探针分子应用于药学、环境科学、生物科学等领域,进行分子水平上的实时检测。细胞内pH值是保持细胞生长、增殖的重要参数。在正常的生理条件下,亚细胞器必须保持特定的pH值以维持细胞生化过程。例如,溶酶体的内部pH值在4.5-5.5范围内,可保证细胞内水解酶在蛋白质、核酸、多糖、脂质以及受损细胞器等生物分子降解中的最佳活性。而线粒体细胞器则需要碱性环境(pH大约在8.0左右)才能维持正常运行。生物硫醇,如半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hey)和谷胱甘肽(GSH),参与多种生物生化过程,在保持生物系统的适当氧化还原状态方面发挥关键作用。Cys和Hey具有解毒功能,是保持生物体免疫能力以及生命系统中细胞和组织老化的生长和延迟所需的重要生物分子。Cys的异常水平与慢生长,脱色,肝损害,肌肉和脂肪损失,皮肤损伤和癌症等密切相关。同型半胱氨酸(Hey)涉及血管和肾脏疾病,被认为是心血管疾病和阿尔茨海默病疾病的危险因素。还原型谷胱甘肽(GSH)是一种细胞内非蛋白硫醇(1-10 mM),在控制氧化应激中起关键作用,并维持细胞生长和功能的氧化还原稳态,异常水平的GSH与各种疾病存在相关性。由于生物硫醇以及细胞内pH值等生物活性分子与疾病的相关性,研究开发能够高效检测与疾病相关生物活性分子的分析技术对于疾病早期诊断、预防性治疗具有迫切的现实意义。基于文献报道以及本实验室前期工作基础,本文围绕生物活性分子的检测,设计、合成了两种具有花菁结构的荧光探针:1)设计、合成一种基于半花菁-苯酚结构的探针1,用于检测细胞在线粒体自噬过程中的pH值变化。探针1在碱性培养基中呈现强橙色荧光,随着细胞内酸性增强,探针的荧光发射呈现绿色荧光。与Mito-Tracker Green FM共染色实验表明,该探针可以选择性地累积在线粒体中,显示探针的线粒体靶向性。细胞成像实验表明,在细胞发生自噬过程中,由线粒体介导的线粒体自噬导致细胞器内pH值发生变化,探针的荧光发射发射了相应变化,表明该探针能够实时监测细胞发生自噬的过程。因此,该探针提供了一个监测细胞自噬的有效工具,并具有应用于细胞内pH值变化检测的潜力;2)设计、合成了具有半花菁-对氨基苯结构的荧光探针2。通过在探针结构中引入丙烯酸酿开关基团,实现了对Cys的选择性检测。实验表明,该探针能够区分与Cys结构和功能上相似的氨基酸和硫醇,并利用高分辨质谱验证了探针对Cys的选择性响应机制。细胞成像实验表明,探针在细胞内发射红色荧光λem = 549nm),当加入Cys共孵育后探针发射绿色荧光(λex = 475 nm),表明该探针能够实现细胞内Cys荧光成像检测。另外,探针2具有高灵敏性、良好的生物相容性等特点,有利于实现生物学领域的检测应用。