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感染性腹泻是由病原微生物(病原菌、病毒)及其产物所引起的以腹泻为主要特征的肠道传染病,是全球发病率高和流行广泛的传染病之一,严重威胁着人类的健康。为了预防感染性腹泻疾病的发生,建立有效、快速地检测和鉴定腹泻致病菌的方法则显得尤为重要。
近年来,随着致病菌的不断变异和新病原菌的出现,感染性腹泻的发生呈上升趋势,由感染性腹泻所引起的死亡率也不容忽视,因此对感染性腹泻的致病菌进行及时的检测则具有重要的现实意义。本研究以引起人类感染性腹泻常见的14种致病菌为研究对象,运用基因芯片技术进行分子生物学检测方法的研究。我们分别以ITS基因、gyrB基因、toxR基因、cadF基因、dnaJ基因、ipaH基因、hugA基因为靶基因,筛选出了针对志贺氏菌、致泻性大肠杆菌、空肠弯曲杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、河弧菌、弗尼斯弧菌、副溶血弧菌、霍利斯弧菌、少女鱼弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、亲水单胞菌和邻单胞菌的特异分子标识,并成功研制了感染性腹泻致病菌的基因检测芯片。
通过对上述特异基因进行比对分别,我们设计了种属特异性探针,经过保守性和特异性的反复筛选验证,最终得到了特异性探针37条。进行了杂交液、杂交时间、杂交温度和洗涤时间等条件优化的实验,对芯片的特异性和灵敏度进行了验证,并成功用于模拟样品实验和实际样品实验。
本研究中基因芯片检测腹泻致病菌的技术是以优化的多重PCR体系为基础的。该芯片实现了高通量检测致病菌的目的,即可以在一份样品中同时检测多种致病菌。芯片的灵敏度达0.1ng/μL,高于普通PCR一个数量级。通过对78株检测范围内菌株和160株范围外菌株进行了探针的筛选,表明感染性腹泻致病菌基因检测芯片具有较高的特异性。
本课题所建立的运用寡核苷酸芯片技术进行的致病菌的检测具有操作简便、实用性强、快速准确、灵敏度高等特点,为今后在致病菌检测、鉴定领域开展进一步的研究和更大规模的使用奠定了可靠的理论与技术基础。