论文部分内容阅读
目的：研究表明胃癌中TF (tissue factor)高表达,并与胃癌的病情进展有关。利用RNA干扰(RNAi)技术,以TF为靶基因,设计构建siRNA真核表达载体,并转染胃癌细胞系BGC一823,然后检测转染前后胃癌细胞增殖能力和凋亡的变化,研究TF基因在介导胃癌细胞生长、凋亡中的作用。方法：1.设计DNA序列(具有短发夹的结构),经退火处理后克隆至载体pGPU6/GFP/Neo中构建重组质粒,转化至大肠杆菌中,摇菌后提取质粒,并进行酶切和序列鉴定。2.使用构建好的重组质粒,通过阳性脂质体介导的方式转染至胃癌细胞后用G418建立稳定细胞系；观察细胞形态,采用RT-PCR检测不同实验组细胞中TFmRNA的表达情况。3.采用CCK8法、流式细胞术,检测TF siRNA作用于胃癌细胞后细胞增殖活性和凋亡的变化。结果：1.所构建的载体pGPU6/GFP/Neo-TF-1、2、3、4经限制性酶切和基因测序证实为TFsiRNA的真核表达载体；2.利用构建成功的四种重组质粒,通过阳性脂质体介导,转染胃癌细胞,RT-PCR检测结果显示TFsiRNA真核表达载体高效而特异地沉默了胃癌细胞中TF基因的表达,但这儿个重组质粒的沉默效果不同,以pGPU6/GFP/Neo-TF-2的抑制效果最好；3.CCK8结果显示：转染TFsiRNA后胃癌细胞的增殖活性有一定程度的降低,与未经处理的对照组细胞及转染空载体的细胞相比差异显著(P<0.05)；4.流式细胞仪检测结果显示转染TF siRNA的胃癌细胞与亲本细胞、阴性对照组细胞相比,细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。结论：1、针对TF因子成功构建siRNA表达载体,并转染胃癌细胞克隆株；2、siRNA靶向表达载体转染胃癌细胞后TF因子的表达显著降低；抑制TF因子的表达可以抑制胃癌BGC-823细胞的生长,诱导其凋亡。3、TF基因可能成为胃癌基因治疗的新靶点。