目前,肥胖迅速向全球蔓延,已经波及到人们概念中该问题并不严重的东南亚地区。因此,肥胖已成为当今全球医学上越来越严重的问题。当人们的体重大大超过推荐的指标就可以确诊为肥胖症,随着肥胖患病率的增高,与肥胖相关的其他慢性非传染性疾病,如糖尿病、代谢综合征、高血压、心脑血管疾病、睡眠障碍、哮喘、肿瘤等的患病率也呈明显上升的趋势。根据流行病学统计,肥胖发生率的增加与成年人群死亡率的增加呈高度相关。近年来的研究表明,肥胖是由特定的生化因子引起的一系列进食调控和能量代谢紊乱而导致的疾病,与遗传、环境、基因、膳食结构有关,而基因是主要的决定因素。从宏观的水平上看,食物摄入增加、体力活动减少和生热机制的改变导致了脂肪的过多堆积;但从微观水平上分析,成熟脂肪细胞的增多是脂质发生累积的关键因素。肥胖已经不仅仅是影响人体形象美观的问题,还是威胁人类健康的问题。被列为世界上第六位的影响全人类疾病负担的危险因素。1950年,Ingalls等发现一个基因的阴性突变可以导致肥胖,他将该基因称为肥胖基因(obese gene,ob gene),第一次出现了ob基因的概念。Coleman等用交叉灌流实验证明,某种血源性因子能调节动物摄食、代谢、参与肥胖形成,且这种因子的产生与ob基因有关。1991年Friedman描述了五种可以使小鼠形成肥胖的单基因突变,分别是obese(ob)、diabetes(db)、fat(fa)、tubby(tub)和obese yellow(A~y),为研究肥胖的分子机制奠定了基础。1994年Zhang等利用突变基因的定位克隆技术克隆了小鼠和人的ob基因,同时发现ob基因的突变可以导致肥胖,使肥胖研究真正进入分子时代。瘦素蛋白(Leptin)是ob基因的产物,是由白色脂肪细胞分泌的一种有167个氨基酸残基组成的蛋白质。它除了通过作用于下丘脑特异性受体发挥抑制饮食、减少能量摄入、减轻体重和增加能量消耗的作用外,同时还通过其它组织器官上的受体(胰岛、肝脏、性腺、肾上腺、甲状腺等)在体内共同形成一个复杂的网络作用系统,影响着机体许多生理系统和代谢通路。瘦素蛋白的外周作用还包括调节糖代谢的平衡、促进脂肪分解、抑制脂肪合成、参与免疫调节功能和促进生长发育等。经过长期的研究,人们对瘦素蛋白的生物学作用已经有更进一步的认识:瘦素蛋白在能量代谢调节中并不是一个孤立的激素,而是与许多神经肽、神经递质、激素及其它因子协同发挥作用;在人群中存在有不可忽视的“瘦素抵抗”现象等。这些都是致力把瘦素蛋白单独用作为治疗肥胖症药物的研究者今后需要解决的问题。随着研究的深入,研究者发现SH2B1β蛋白能与瘦素激活的细胞信号蛋白JAK2(非受体酪氨酸激酶)相互作用,调节能量代谢和体重。SH2B1β是SH2B信号接头蛋白家族中的一员,其结构上有SH2结构域,可以结合磷酸化的酪氨酸残基,进而连接不同的信号蛋白,发挥其衔接信号及强化信号通路的作用。SH2B1β广泛分布于下丘脑、肝脏、胰脏、脂肪组织等组织中,参与胰岛素敏感性和血糖平衡的调节以及增强神经生长因子诱导的神经分化。由于SH2B1β是Leptin/JAK2信号通路活化所必需的,如果敲除小鼠的SH2B1β基因,将使小鼠的体重是同窝正常组小鼠的两倍,SH2B1β基因缺失导致严重的瘦素抵抗,食欲过盛和肥胖。SH2B1β通过自身结合JAK2同时募集胰岛素底物蛋白(IRS)结合JAK2复合体,以JAK2/STAT3和IRS2/PI3K两条路径来增强瘦素依赖的信号转导,因而SH2B1β是一种内源的瘦素敏感性增强剂,同时,SH2B1β的过表达还可以抵消蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)介导的瘦素抑制信号的作用。目前有最新的文献报道指出,脂肪组织与神经组织中的SH2B1β在脂肪细胞的生长分化过程中产生两种相反的效应。虽然神经组织SH2B1β的负调节效应占优,但是脂肪组织SH2B1β是以一种细胞自主的方式来调节脂肪细胞的分化,并在3T3-L1前脂肪细胞的分化过程中呈现表达量进行性增加,同时促进细胞中脂滴的累积以及脂肪分化转录因子PPARγ、C/EBPα的表达。脂肪细胞数量的增多和体积的增大能导致肥胖,而前脂肪细胞分化的增加则是导致成熟脂肪细胞数量增多的主要原因,近年来脂肪细胞的分化调控已成为肥胖及其相关疾病的研究热点。人或动物的脂肪组织成份包括微血管、神经组织、成纤维细胞、脂肪细胞以及前脂肪细胞,脂肪细胞系的发育过程为多能干细胞—间充质干细胞—前脂肪细胞—成熟脂肪细胞,所以有效的调节前脂肪细胞的分化能控制脂肪组织增生、肥大。脂肪细胞分化与胰岛素和胰岛素样生长因子相关,胰岛素和胰岛素样生长因子通过结合其受体激活PI3K和MAPK两条信号转导通路,促进脂肪细胞的分化。SH2B1β作为一种胰岛素受体(IR)和胰岛素样生长因子受体(IGF-IR)活性的正调节蛋白,参与调控脂肪细胞分化的信号通路。目前有关脂肪组织SH2B1β的研究很少,而且研究主要是针对鼠源蛋白。根据文献报道SH2B1β鼠源基因与人源基因的相似性达到85%-87%,本课题着眼于使用人源的SH2B1β基因在体外原核表达重组蛋白后,制备抗SH2B1β的单克隆抗体,通过定性及定量的方法初步探讨该人源蛋白在人源前脂肪细胞分化中的调控作用,为治疗与前脂肪细胞分化关系密切的肥胖及其并发症提供新的药物靶点。由于脂肪干细胞是临界于间充质干细胞与前脂肪细胞时期之间的一种细胞状态,所以本研究通过体外原代培养脂肪干细胞(ADSC)并诱导其成脂分化,收集分化成熟的脂肪细胞后,用TRIZOL一步法提取细胞总RNA。运用RT-PCR方法成功扩增并克隆出SH2B1β基因片段,将所得的目的基因克隆至pET28a(+)表达载体,并在大肠杆菌中进行了大量可溶性表达。用饱和硫酸铵盐析法和DEAE阴离子交换法纯化重组蛋白,重组蛋白通过抗His-tag单抗鉴定后免疫小鼠制备单克隆抗体,分别用ELISA、Western-Blot法检测及鉴定单克隆抗体的特异性。利用RT-PCR技术成功克隆了SH2B1β基因,其大小约为2000bp。经测序并与GenBank中序列进行比对,结果显示插入片段与已报道的SH2B1β基因序列配对一致,无移码突变,大小为2016bp。将编码基因克隆到pET-28a(+)原核表达质粒中,经PCR、限制性酶切分析等鉴定,证实成功构建了SH2B1β-pET28a(+)重组原核表达质粒。经IPTG诱导后,重组质粒SH2B1β-pET28a(+)在大肠杆菌E.coli DE3中表达出His-tag融合重组蛋白,分子量约为80kDa,与理论值基本符合。表达产物主要以可溶性形式存在。经过纯化后,重组蛋白纯度可达80%以上。用抗His-tag单抗对表达产物进行Western-blot分析,可见特异性区带出现,表明该蛋白确实是所要表达的His-tag融合蛋白。进一步用纯化的表达产物免疫小鼠制备免疫血清,ELISA分析表明重组蛋白能与该免疫血清起反应,而与正常小鼠血清不发生交叉反应,说明重组蛋白具有抗原活性。将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合后筛选到2株单抗分泌细胞。以纯化重组蛋白为抗原,用ELISA法检测单抗细胞株培养上清的效价,OD值分别为1.553～2.210。Western-blot结果显示:抗SH2B1β的2株单抗与人源脂肪组织内提取的天然蛋白发生特异性反应,而阴性对照组则无明显条带出现,说明制备的单抗均为特异性单抗。以上结果表明,我们已经成功地构建了SH2B1β-pET28a(+)原核重组表达质粒,目前国内尚未见关于SH2B1β重组并表达的相关报道。而且在大肠杆菌中大量表达出具有免疫活性的可溶性重组蛋白SH2B1β;筛选并建立了2株分泌抗SH2B1β单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为进一步研究该蛋白的生物学功能、在脂肪细胞发育分化过程中所起的作用、对肥胖症潜在治疗价值的验证奠定基础。