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脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)属于缺血性脑血管疾病,主要是由脑部因长时间缺血,血管再通血后加重缺血性损伤造成的。在CIRI过程中,活性氧的产生可引起脑脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤,导致神经功能障碍和细胞死亡。目前CIRI治疗仍是临床医生面临的一个挑战。CIRI的发病机制十分复杂,研究其相关基因功能对其治疗具有重要的意义。微小RNA(MicroRNA,miRNAs)是一组保守的、小的、非编码RNA,通常长度为18～25个核苷酸,可以调控靶基因表达。有研究证实,敲除miR-155通过调控RACK1表达和去活化MAPK/NF-κB和mTOR信号通路,进而可以保护LPS诱导的小胶质细胞BV2炎性损伤。小胶质细胞可以产生炎性介质和神经毒性的化合物,如IL-1β、IL-6、TNF-α、活性氧、一氧化氮和前列腺素E2等,它们均是脑缺血神经元死亡的重要决定因子。因此,miR-155可能在CIRI中发挥着重要的作用。MafB,MAF转录因子家族的成员,在人体组织中广泛表达,但在髓系细胞中含量特别高,有助于单核细胞-巨噬细胞系的建立和维持。前期通过生物信息学预测发现,MafB是miR-155的靶基因。另外,据研究表明,miR-155-5p可以通过靶向抑制MafB的表达,可以促进IL-6和GLP的表达,从而降低血糖。然而,miR-155靶向MafB在CIRI中的具体作用还未见有研究。SH-SY5Y细胞是人类神经母细胞瘤细胞,其形态、神经化学和电生理特性与神经元相似,已被广泛用作研究神经元损伤或死亡的体外模型。本课题为研究miR-155靶向MafB在CIRI中的作用,首先利用qRT-PCR检测miR-155和MafB在正常人血浆和急性脑梗死后合并再灌注损伤的患者血浆中的表达情况,并利用GraphPad Prism 7分析miR-155和MafB在CIRI患者血浆中的表达相关性;在体外,构建miR-155过表达和敲除载体,利用SH-SY5Y细胞做氧糖剥夺再复氧(OGD/R)模型,探讨了 miR-155过表达和敲除对OGD/R SH-SY5Y细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移、细胞因子分泌以及MafB表达的影响;又利用生物信息学分析了 miR-155与MafB的靶向关系,建立MafB敲除载体,探讨了miR-155靶向MafB对OGD/RSH-SY5Y细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移以及细胞因子分泌的影响;最后拟体内研究,利用线栓法建立了小鼠CIRI模型(MCAO),在侧脑室注射miR-155 mimic和miR-155 antagomir,利用TTC法、免疫组化、Western blot和ELISA检测了 miR-155对MCAO小鼠脑梗死体积、脑组织中MafB、IL-1β、IL-6 和 TNF-α、iNOS 和 COX-2 水平的影响,进一步探讨了 miR-155靶向MafB对小鼠CIRI模型的影响。本研究主要分为三部分:第一部分:miR-155和MafB在脑缺血再灌注损伤患者血浆中的表达;第二部分:miR-155靶向MafB在体外细胞缺血再灌注模型中的作用;第三部分:miR-155靶向MafB对小鼠脑缺血再灌注损伤模型的影响。主要内容:第一部分:miR-155和MafB在脑缺血再灌注损伤患者血浆中的表达方法1.qRT-PCR检测miR-155和MafB在正常人和CIRI患者血浆中的表达。2.利用GraphPad Prism 7分析miR-155和MafB在CIRI患者血浆中的表达相关性。结果与正常血浆相比,在CIRI患者血浆中miR-155表达明显上调,而MafB表达明显下调,且二者表达呈负相关。第二部分:miR-155靶向MafB在体外细胞缺血再灌注损伤模型中的作用方法1.建立氧糖剥夺再复氧(OGD/R)SH-SY5Y细胞模型,利用qRT-PCR检测miR-155和MafB在OGD/R SH-SY5Y细胞中的表达。2.构建miR-155过表达和干扰慢病毒载体,重组慢病毒经包装和滴定后感染SH-SY5Y和OGD/R SH-SY5Y细胞,得到稳定细胞系。并用qRT-PCR检测miR-155和MafB在各组OGD/R SH-SY5Y细胞中的表达。3.MTT实验检测不同处理组SH-SY5Y细胞的增殖情况。4.流式细胞术检测不同处理组SH-SY5Y细胞的凋亡情况。5.Transwell小室实验检测不同处理组SH-SY5Y细胞的侵袭情况。6.划痕实验检测不同处理组SH-SY5Y细胞的迁移情况。7.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测不同处理组SH-SY5Y细胞培养上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。8.双荧光素酶报告基因实验验证miR-155和MafB之间的关系。9.Western blot检测不同处理组SH-SY5Y细胞中MafB、iNOS和COX-2蛋白的表达情况。结果1.与对照细胞相比,在OGD/R处理过的SH-SY5Y细胞中miR-155的表达明显升高,MafB的表达明显降低。2.miR-155过表达明显抑制OGD/R SH-SY5Y细胞的增殖、侵袭和迁移,并促进细胞凋亡以,增加OGD/RSH-SY5Y细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平以及细胞中iNOS和COX-2的表达;而miR-155敲除明显促进OGD/R SH-SY5Y细胞的增殖、侵袭和迁移,并抑制细胞凋亡,减少OGD/R SH-SY5Y细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平以及细胞中iNOS和COX-2的表达。3.miR-155靶向MafB能够抑制OGD/R SH-SY5Y细胞的增殖、侵袭和迁移,并促进其凋亡,增加OGD/RSH-SY5Y细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平以及细胞中iNOS和COX-2的表达。第三部分:miR-155靶向MafB对小鼠脑缺血再灌注损伤模型的影响方法1.使用线栓法构建MCAO模型,在小鼠侧脑室注射miR-155 mimic和miR-155 antagomir,利用TTC法检测不同处理组MCAO小鼠脑梗死体积。2.Western blot和免疫组化检测miR-155对MCAO小鼠脑组织中MafB蛋白表达的影响。3.qRT-PCR检测各组MCAO小鼠脑组织中miR-155、iNOS和COX-2的表达情况。4.ELISA检测MCAO小鼠脑组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。5.Western blot检测MCAO小鼠脑组织中iNOS和COX-2蛋白的表达情况。结果利用MCAO模型研究发现,miR-155可能通过靶向抑制MafB的表达,进而增加脑梗死体积,促进IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS和COX-2的水平,最终促进MCAO导致的炎症反应,增加脑损伤。全文总结1.在CIRI患者血浆中miR-155表达明显上调,而MafB表达明显下调,且二者表达呈负相关。2.miR-155靶向MafB能够抑制OGD/R SH-SY5Y细胞的增殖、侵袭和迁移,并促进其凋亡,增加OGD/R SH-SY5Y细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平以及细胞中iNOS和COX-2的表达,最终加剧神经细胞损伤和炎症反应。3.利用MCAO模型进一步研究发现,miR-155可能通过靶向抑制MafB的表达,进而增加脑梗死体积,促进IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS和COX-2的水平,最终促进MCAO导致的炎症反应,增加脑损伤。