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植物病毒病是危害农业生产的重要病害之一。病毒的绝对寄生性给抗病毒剂的研制带来困难,至今国内外缺少有效的抗病毒药剂。本文通过活性跟踪法从中草药植物天葵(Semiaquilegiaadoxoides)块根中提取分离对烟草花叶病毒(TMV)具有生物活性的化学成分,主要结果如下:
1.本研究明确了对天葵化学成分初分离的方法,采用系统溶剂提取法提取天葵中的活性成分,得到天葵石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇和水提取物,并计算了天葵初提物的总提取率为38.76%。
2.用烟叶半叶枯斑法进行抗TMV活性测定,首次发现天葵块根七种不同溶剂的提取物都具有一定的作用效果。体外钝化试验得出如下结果:天葵提取物对TMV的钝化作用范围为34.12%-68.09%,其中天葵石油醚、丙酮和乙醇提取物的效果最好,钝化效果分别为68.09%,63.28%和60.59%;在离体保护和治疗作用试验中,石油醚提取物保护作用最好,抑制率达65.26%,丙酮提取物治疗抑制率达34.24%,均显著高于对照药剂病毒A。
3.经活性追踪发现了天葵石油醚提取物中的三种化合物β-谷甾醇、油酸和硬脂酸对TMV的作用效果,研究结果表明β-谷甾醇、油酸和硬脂酸都具有一定的抗TMV活性。在浓度10mg/mL时,离体试验结果表明硬脂酸对TMV的钝化效果达56.86%,β-谷甾醇为50.73%,硬脂酸的保护作用达57.48%,而油酸的治疗效果为37.41%,均显著好于对照药剂病毒A。在活体试验中,硬脂酸和β-谷甾醇的钝化效果较好,抑制率分别为60.50%和57.14%,硬脂酸的活体保护作用最好,抑制率达48.82%,油酸的抑制率为38.30%,而且对接种病毒后的治疗作用也较好,2h、24h、48h后的抑制率分别为58.33%、46.15%、42.27%,试验中还发现用离体接种和活体接种方法,对生测结果有一定的影响,但其趋势是一致的。
4.进一步研究发现,硬脂酸等化合物对TMV侵染的抑制率随着浓度的增加而升高。硬脂酸对TMV的保护作用结果表明在较低的浓度范围内(1.25-5mg/mL),随着浓度的升高其抑制作用明显增强,但在10-20mg/mL浓度范围内,其抑制效果上升缓慢。在1.25mg/mL浓度时,硬脂酸对TMV的保护效果较弱,抑制率为15.68%,但随着浓度的上升,其抑制率明显增强,在2.5mg/mL浓度时,抑制率为30.47%,5mg/mL浓度时,抑制率为57.48%,5mg/mL浓度后,抑制作用相对缓慢上升。而硬脂酸对TMV的治疗作用随浓度增加也呈增长趋势,在1.25mg/mL浓度时,抑制率为12.81%,当浓度为20mg/mL时,抑制率达37.96%;油酸对TMV的治疗效果较好,在1.25mg/mL浓度时,抑制率为21.63%,在20mg/mL时,抑制率为38.71%,β-谷甾醇对TMV治疗抑制率在浓度为1.25mg/mL时为18.75%,在20mg/mL浓度时为27.08%,抑制率变化不大。
5.体外钝化时间对抑制作用存在一定的影响。β-谷甾醇与TMV等量混合不同时间后接种试验表明,混合5min后接种,抑制率较低,只有11.58%,混合10min后接种,抑制率达42.52%,但混合30min、60min后,抑制率相当,分别为56.38%、61.03%,结果表明β-谷甾醇与TMV混合作用需要一定时间,其抑制率才能达到较高水平,但当混合时间超过30min后,其抑制作用虽有所增强,但增加缓慢。