研究背景真菌性角膜炎(Fungal keratitis)是一种潜在的威胁视力的疾病,近年来在美国和中国的发病率急剧增加,因此需要及时准确的诊断和积极的治疗,以防止视力下降。在美国和其他工业化国家,长期佩戴隐形眼镜是真菌性角膜炎的首要原因；而在发展中国家,农业劳动是主要的危险因素。近年来,随着免疫抑制剂的广泛使用,长期使用广谱抗生素和艾滋病也被视为真菌性角膜炎的危险因素。真菌性角膜炎是感染性角膜病中最具挑战性的疾病之一,近几年,真菌性角膜炎发病率已上升到感染性角膜病的首位(占51%-70%),因此,真菌性角膜炎的防治研究已成为我国致盲性眼病的重大科学问题。真菌性角膜炎在热带、亚热带地区发病率高,有超过105种真菌可引起眼部感染,主要是镰孢属、弯孢属、曲霉属和念珠菌属四大类,而在我们国家,真菌性角膜炎主要致病菌为镰刀菌属,约占感染病例的70%-80%,次之为曲霉菌属,约占10%,念珠菌属只占2%。因此,只有更好地理解角膜抗真菌感染的免疫防御分子机制才能更好地制定详细的治疗策略。一般情况下,真菌不会侵犯正常角膜,但当角膜上皮破坏,角膜基质暴露时,真菌可以通过破损处侵入上皮下层及基质层,引起真菌性角膜炎。角膜上皮细胞参与宿主的固有免疫反应,抵抗真菌入侵。角膜上皮细胞(Corneal epithelial cells)是构成角膜天然免疫防御系统的主要组成细胞,是抵抗病原微生物感染的第一道防线。因此,角膜上皮细胞识别病原微生物组分的生物学功能是非常重要的。由真菌引起的宿主角膜天然免疫应答有赖于其模式识别受体家族(Pattern recognition receptors, PRRs)对特定病原体的快速识别,如Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)。PRRs的活化引发一系列的炎症信号转导级联反应,包括炎性细胞的浸润(多形核嗜中性粒细胞和单核细胞／巨噬细胞),Th2型细胞因子(IL-4,IL-6和IL-10),趋化因子(IL-8),促炎性细胞因子(TNF-α和IL-的1β)和抗菌肽(hBD2及LL37)的生成,从而清除病原体。本课题组在前期研究中率先证实,TLR2和TLR4是角膜上皮细胞识别细胞外烟曲霉菌的主要受体,通过激活多个信号转导通路(NF-κB和ERK)介导促炎症细胞因子的产生。但是,TLR2和TLR4受体主要位于角膜上皮细胞的细胞膜上,是否还存在其他模式识别受体能够识别侵入胞内的真菌目前尚不清楚。最近的研究显示模式识别受体的另一个家族,核苷酸结合寡聚化结构域(Nucleotide-binding oligomerization domain, NOD)蛋白家族,能识别侵入细胞的“内部”信号("inside-in"signalling),以“细胞内监视”的方式调控机体的天然免疫防御机制。其中,NOD1能识别特定的细菌成分二氨基庚二酸(y-D-glutamyl-meso-diaminopilemic acids, iE-DAP),其通过激活核转录因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和MAPK信号传导通路诱导炎性细胞因子的分泌和抗菌肽的生成,启动宿主细胞防御病原体感染的固有免疫反应。目前的研究揭示NOD1在多种器官,如肺,肠和口腔的病毒和真菌感染中都发挥着至关重要的作用。然而,NOD1在人角膜上皮细胞(Human comeal epithelial cells, HCECs)抗真菌的天然免疫炎症反应中的作用我们却知之甚少。目前的研究发现,NOD蛋白与真菌感染密切相关。Zhang HJ等发现NOD蛋白在烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus,A. fumigatus)分生孢子感染小鼠肺组织的天然免疫反应中发挥着重要的作用。那么,在人角膜上皮细胞中,NODs如何识别真菌,发挥抗真菌作用?具体机制如何?回答这些问题将更清楚地揭示角膜识别真菌、启动免疫防御反应的机理,对角膜抗真菌感染免疫调控及角膜天然免疫提供全新的理论,为角膜真菌感染的防治、新药的靶点设计及新型疫苗的开发开辟新的思路,有重要的临床意义和社会价值。因此,本研究采用NOD1特异性配体iE-DAP和热灭活的烟曲霉菌分生孢子作为干扰因素,观察人永生化角膜上皮细胞(Human telomerase-immortalized corneal epithelial cells, THCEs)中NOD1,炎性细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-8)以及抗菌肽(hBD2、LL37)的表达变化,探讨NOD1在人角膜上皮细胞中的作用及机制。全文共分两部分：(一)NOD1蛋白在烟曲霉菌感染人角膜上皮细胞固有免疫反应中的表达与作用的研究；(二)NOD1蛋白介导烟曲霉菌感染人角膜上皮细胞固有免疫反应中的作用机制的研究。第一部分NOD1在烟曲霉菌感染人角膜上皮细胞固有免疫反应中的表达及作用的研究[目的]研究核苷酸结合寡聚化结构域(Nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)相关蛋白NOD1在烟曲霉菌感染人角膜上皮细胞引起的天然免疫反应过程中的表达与作用。[方法]1.用F12/DMEM培养液培养人永生化角膜上皮细胞,将培养的人永生化角膜上皮细胞随机分为3组：实验组1,2和空白对照组,3组分别更换NOD1的特异性配体(iE-DAP,20μg/ml)、热灭活的烟曲霉菌孢子刺激液、F12/DMEM培养液,Oh,1h,2h,4h,8h,12h,24h后收集细胞及上清液；2.根据基因组数据库设计靶向人NOD1的siRNA序列,用F12/DMEM培养液培养人永生化角膜上皮细胞,将培养的人永生化角膜上皮细胞随机分为2组：实验组和阴性对照组,NOD1-siRNA转染实验组THCEs24h后,再用热灭活的烟曲霉菌孢子刺激液(1×105个/m1)分别刺激2组细胞,4h后收取细胞及上清液；3. Real-time RT-PCR检测不同刺激下THCEs中NOD1,抗菌肽LL37及hBD2mRNA的表达；Western Blotting检测NOD1的表达；免疫荧光检测NOD1蛋白的表达变化；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中的TNF-α、IL-6和IL-8的分泌,并进行统计学分析。[结果]NOD1特异性配体iE-DAP及烟曲霉菌孢子均可刺激THCEs中NOD1的mRNA以及蛋白的表达呈时间依赖性增高,炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-8和抗菌肽LL37,hBD2mRNA的分泌增多。NOD1-siRNA转染THCEs后,NOD1mRNA以及蛋白水平均受到显著抑制。敲除NOD1能减弱烟曲霉菌诱导的NOD1表达增高,炎性因子和抗菌肽的分泌增加。[结论]NOD1配体可诱导角膜上皮细胞的天然免疫反应；角膜上皮细胞通过NOD1识别胞内的烟曲霉菌并介导炎性细胞因子和抗菌肽的分泌。因此,NOD1是角膜上皮细胞抗真菌天然免疫反应中的关键因素,表明NOD1可能是真菌性角膜炎治疗中一个潜在的新的治疗靶点。第二部分NOD1蛋白介导烟曲霉菌感染人角膜上皮细胞固有免疫反应中的作用机制的研究[目的]研究NOD1在烟曲霉菌诱导的人角膜上皮细胞的固有免疫反应中的关键信号转导通路。[方法]1.用F12/DMEM培养液培养人永生化角膜上皮细胞,将培养的人永生化角膜上皮细胞随机分为3组：实验组1,2和空白对照组,3组分别更换NOD1的特异性配体(iE-DAP,20μg/ml)、热灭活的烟曲霉菌孢子刺激液、F12/DMEM培养液,Oh,1h,2h,4h,8h,12h,24h后收集细胞及上清液；2.根据基因组数据库设计靶向人NOD1的siRNA序列,用F12/DMEM培养液培养人永生化角膜上皮细胞,将培养的人永生化角膜上皮细胞随机分为2组：实验组和阴性对照组,NOD1-siRNA转染实验组THCEs24h后,再用热灭活的烟曲霉菌孢子刺激液(1×105个/m1)分别刺激2组细胞,4h后收取细胞及上清液；3. Real-time RT-PCR检测不同刺激下THCEs中NOD1,下游信号转导通路中的关键分子RIP2、NF-κB p65,抗菌肽LL37及hBD2mRNA的表达：Western Blotting检测NOD1及信号通路分子RIP2、NF-κB p65的表达；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中的TNF-α、IL-6和IL-8的分泌,并进行统计学分析。[结果]NOD1siRNA转染人角膜上皮细胞后,NOD1mRNA以及蛋白水平表达均受到显著抑制。iE-DAP或热灭活的烟曲霉菌孢子刺激THCEs后,对照组下游信号转导通路中的关键分子RIP2、NF-κB p65,炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-8及抗菌肽LL37和hBD2的表达上调,而NOD1siRNA处理组下游信号转导通路中的关键分子,炎性细胞因子及抗菌肽的分泌较对照组明显降低。[结论]在角膜上皮细胞固有免疫系统中,NOD1作为关键的受体,能特异性的介导NOD1特异性配体或烟曲霉菌孢子引起的机体天然免疫反应。而RIP2依赖的NF-κB信号传导途径中关键因子的表达变化在介导烟曲霉菌诱导的宿主天然免疫反应中可能起着关键性的作用。