苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一类广泛存在于土壤中的革兰氏阳性细菌,能在形成芽胞的同时大量表达各种晶体蛋白并在胞内累积包装成伴胞晶体。苏云金芽胞杆菌产生的各种晶体蛋白对多种农业害虫有很好的毒杀效果,作为生物杀虫剂在全球广泛的应用于农林业生产,被认为具有潜在的转基因抗虫育种价值。本论文主要开展了苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白结构与功能方面的研究,研究内容主要涉及晶体蛋白杀线虫毒性区的确定、晶体蛋白溶解性和毒力的改造、晶体蛋白结构域中个别氨基酸残基的功能探讨等。同时本论文也包括了我在硕士期间的部分研究内容(见第四章)。本论文的主要研究内容和结果分列如下：1)苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白Cry55Aa毒性区的确定转基因抗虫育种被公认为极具潜力的控制农林害虫的措施。有许多的研究证明,苏云金芽胞杆菌的大部分晶体蛋白存在一个杀虫的毒性区,而不需要全长的蛋白序列,这些研究结果提示转基因抗虫育种研究可以用比全长小很多的毒性区序列。在本研究论文中,生物信息学分析显示晶体蛋白Cry55Aa在NCBI蛋白质数据库中没有与其同源的蛋白序列,表明晶体蛋白Cry55Aa是一个全新的杀线虫晶体蛋白,推测该晶体蛋白可能具有一个全新的杀虫模式,同时其毒性区也无法通过生物信息学分析来进行准确的预测。本研究构建了晶体蛋白Cry55Aa的一系列截短缺失突变体并在大肠杆菌中诱导表达,生物测定的结果显示所有截短的片段都失去了对线虫的毒性作用,其中包括从N端或C端截去30氨基酸残基的缺失蛋白。这一结果说明晶体蛋白Cry55Aa没有一个明显的非毒性区,这与苏云金芽胞杆菌的其他杀虫晶体蛋白有明显的不同。根据这一结果,我们建议转基因抗虫育种研究用全长的Cry55Aa蛋白序列。2)苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白Cry5Ba毒性区的确定研究发现,苏云金芽胞杆菌产生的大分子量(130-140kD)晶体蛋白在靶标害虫肠道中在寄主中肠酶的作用下截去N端的部分序列和整个C半段,形成一个小分子量(60-70kD)的核心活性蛋白。本研究对苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白Cry5Ba的生物信息学分析表明晶体蛋白Cry5Ba也是一个典型的大分子量蛋白,并预测其毒性区间为70-700氨基酸。基于这种预测,本研究通过大片段缺失,构建了晶体蛋白Cry5Ba的一系列缺失突变体,并分别在大肠杆菌和苏云金芽胞杆菌中表达。生物测定的结果表明,从晶体蛋白Cry5Ba的N端截去10个氨基酸残基的缺失突变体的杀线虫活性与全长的Cry5Ba无明显的差异,而截去21个氨基酸残基的缺失体蛋白对线虫的毒性明显的降低。这一结果说明晶体蛋白Cry5Ba的N端部分序列是其杀线虫必需的,这和苏云金芽胞杆菌的其他大分子量晶体蛋白有明显的不同。另外从晶体蛋白Cry5Ba的C端截去550个氨基酸的缺失突变体的杀线虫活性与全长的Cry5Ba没有明显的差异,说明Cry5Ba的C半段是非毒性区,这一点与其他的大分子量晶体蛋白类似。根据这些结果,我们建议在转基因抗虫育种研究中用Cry5Ba的整个N半段序列,即1-715氨基酸残基。3)苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白Cry5Ba的毒力改造苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白Cry5Ba是一个对线虫高毒力的蛋白,但是面临寄主潜在的抗性威胁。本研究通过生物信息学分析、结构域和活性区预测以及蛋白质三维结构模拟,在晶体蛋白Cry5Ba的结构域Ⅱ和结构域Ⅲ中潜在的与毒性相关的氨基酸进行了单个氨基酸的点突变,构建了晶体蛋白Cry5Ba的19个点突变体。生物测定的结果显示,在相同的蛋白浓度和相同的处理时间,突变体蛋白Y393A和N586A比野生型Cry5Ba更严重的抑制了秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的生长,说明这两个突变体蛋白增强了蛋白质的杀线虫活性。统计分析的结果显示突变体蛋白Y393A和N586A对线虫的毒力分别升高了3.72倍和5.58倍。同时晶体溶解性实验结果表明在偏酸性pH值环境下突变体N586A晶体比野生型Cry5Ba晶体的溶解性增强,我们推测这可能有利于突变体蛋白在寄主酸性肠道中的溶解和活化,从而增强了其杀线虫活性。4)穿刺巴斯德杆菌防治植物根结线虫的效果评价穿刺巴斯德杆菌是植物根结线虫的专性寄生细菌,其胞子可以特异性的粘附到敏感寄主线虫的体表,在寄主线虫侵入植物后细菌胞子开始萌发产生芽管,并在寄主线虫体内扩展蔓延,最后在线虫的卵巢内繁殖产生后代胞子,使寄主线虫失去产卵能力。为了评价穿刺巴斯德杆菌防治植物根结线虫的效果,本研究从国外引进了穿刺巴斯德杆菌的胞子,并对其侵染植物根结线虫的方式、部位、防治效果和寄主特异性进行了初步的调查和研究。结果显示在本研究调查的植物根结线虫群体中,大部分(72.08%)的植物根结线虫对引进的穿刺巴斯德杆菌胞子不敏感,25.53%的植物根结线虫对引进的穿刺巴斯德杆菌胞子特别敏感,说明穿刺巴斯德杆菌侵染植物根结线虫具有很强的寄主特异性。同时本研究表明穿刺巴斯德杆菌胞子粘附敏感植物线虫并没有部位选择特异性,在线虫的所有部位都发现有胞子的粘附。