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研究背景淋巴瘤(Lymphoma)是一种淋巴细胞克隆性增生的淋巴造血系统的恶性肿瘤,B细胞淋巴瘤占大多数,其治疗方案一直采用多药联合化疗及放疗。随着研究的深入,出现了分子靶向药物美罗华,针对淋巴瘤细胞的特征性抗原进行靶向杀伤,淋巴瘤的治疗效果得到明显的提高,但多药耐药淋巴瘤的治疗仍然存在很大的困难。近年来,异基因造血干细胞移植和细胞免疫治疗应用于淋巴瘤的治疗当中,取得很好的疗效。在异基因造血干细胞移植和免疫治疗中NK细胞一方面能够降低移植物抗宿主病(GVHD)的发生率,另一方面能够介导移植物抗白血病(GVL)效应杀伤白血病细胞,降低复发率,在机体抗肿瘤免疫机制中起到重要作用。有研究报道发生耐药的肿瘤细胞能够逃逸NK细胞的杀伤,成为肿瘤复发的根源。本研究应用药物地塞米松(DXM)体外诱导B细胞淋巴瘤SU-DHL-4(SU)细胞发生耐药,建立SU/DXM细胞系,观察SU细胞及发生耐药后SU/DXM细胞对NK细胞杀伤敏感性的差异,并应用RT-PCR、流式细胞术等方法来研究分析其发生的分子机制。目的研究多药耐药的B细胞淋巴瘤细胞逃逸NK细胞免疫杀伤的分子机制。研究方法第一章人B细胞淋巴瘤细胞系SU细胞和SU/DXM细胞的生物学特性用20μg/ml DXM处理SU细胞,直至其生长稳定。显微镜下观察SU及SU/DXM细胞的细胞形态、生长状态;流式细胞仪分析细胞周期分布;计数法绘制细胞生长曲线;MTT法分析耐药谱及IC50值。第二章NK细胞对SU细胞和SU/DXM细胞的体外杀伤活性提取3例正常人外周血单个核细胞,流式细胞仪分选得高纯度NK细胞作为效应细胞,以SU及SU/DXM细胞作为靶细胞,采用CFSE与PI染色法用流式细胞仪检测效靶比20:1时NK细胞对SU及SU/DXM细胞的体外杀伤活性。第三章SU/DXM细胞体外逃逸NK细胞免疫杀伤机制的初步研究提取SU细胞和正常人外周血单个核细胞DNA;采用序列特异性引物扩增法PCR-SSP测定正常人NK细胞KIR基因型以及SU细胞HLAⅠ类分子基因型。RT-PCR检测SU和SU/DXM细胞NKG2D配体基因的表达情况。结果第一章人B细胞淋巴瘤细胞系SU和SU/DXM细胞的生物学特性1.SU细胞为圆形,呈悬浮生长,细胞体积较大。细胞周期检测比例如下: G0/G1 43.6%、S期48.5%、G2/M 7.97%; SU/DXM细胞仍为悬浮生长,细胞周期中G0/G1细胞为50.9%,G2/M期细胞为13.8%,S期细胞为35.3%,G0/G1细胞较SU细胞增多。显微镜下生物学特性没有明显改变。2.耐药后的SU细胞对DXM、ADM、L-asp和Vp-16的耐药倍数分别为耐药前的8.59、3.64、2.98和2.61倍,细胞对多种化疗药物耐药为多药耐药(MDR)细胞,用SU/DXM细胞表示。第二章NK细胞对SU细胞和SU/DXM细胞的体外杀伤活性1.流式细胞仪分选的NK细胞纯度大于90%,且细胞状态良好,活性大于95%,能够满足实验需求。2.CFSE与PI染色法检测杀伤,结果显示效靶20:1时,NK细胞对SU细胞的杀伤活性为(25.45±3.21)%,对SU/DXM细胞的杀伤活性为(11.42±2.43)%。在同一效靶比,NK细胞对SU细胞和SU/DXM细胞的杀伤活性组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。第三章SU/DXM细胞体外逃逸NK细胞免疫杀伤机制的初步研究1.3例正常人NK细胞均表达KIR,包括KIR2DL1,KIR2DL3,KIR3DL1,KIR3DL2等。2.SU细胞HLA-I类基因型为A 68,68;B 15(B75),15(B75);Cw 03,08。3.SU和SU/DXM细胞在mRNA水平均表达各种NKG2D的配体基因。RT-PCR检测结果显示,SU/DXM细胞MICA、MICB、ULBP2基因的表达量较SU细胞明显降低,两者相比差异具有显著的统计学意义(P<0.05);NKG2D相关配体表达量下降与多药耐药细胞对NK细胞的免疫杀伤敏感性降低有相关性(P<0.05)。结论1.DXM长期处理SU细胞能够体外诱导其发生MDR。2.SU/DXM细胞不仅能够抵抗化疗药物杀伤,而且能够抵抗免疫杀伤。