化妆品是日常生活中的必需品,化妆品的微生物污染不仅会造成产品质量下降,给生产厂家带来经济损失,还可能直接影响消费者的健康。目前,国内外对化妆品微生物污染问题以及防腐效能评价方法等都进行了一定的研究,但是还缺少深入性、系统性的资料,尤其是在防腐效能评价方面,到目前为止还没有一套标准化的评价方法。因此,为了进一步全面系统的了解化妆品的微生物污染状况,建立适合我国实际情况的化妆品防腐效能评价方法,保护消费者和生产者的利益,本课题从以下几个方面进行了研究:一、化妆品中微生物污染状况调查及种属分布的研究1.化妆品微生物污染状况调查表明,现阶段的污染以菌落总数最重,超标率为4.85%,霉菌、酵母菌总数次之,超标率为2.91%,总不合格率为7.77%,污染以添加有特殊营养物质的化妆品占多数。经分离鉴定,细菌有肠杆菌、泛菌属、假单胞菌、葡萄球菌等,其中革兰氏阴性杆菌占71.4%,霉菌有青霉菌、木霉菌、拟青霉菌和毛霉菌。了解了现阶段化妆品的微生物污染状况及危害性,为选择化妆品用防腐剂、筛选微生物挑战性实验用菌株提供了参考依据。2.采用最小抑菌浓度法,测试化妆品中污染微生物对常用防腐剂的抵抗性。结果显示其中部分微生物对受试防腐剂中的一种或几种抵抗性较高,例如日沟维肠杆菌对对羟基苯甲酸甲酯的耐受剂量达到了10mg/ml,为该防腐剂限用剂量的2.5倍。提示在化妆品中污染的微生物可能对常用防腐剂产生了耐受性,而且可能是化妆品微生物污染的原因之一,在防腐剂的选用过程中应引起重视。3.利用《化妆品卫生规范》规定的高效液相色谱法测定微生物超标和无微生物检出的化妆品中12种防腐剂的种类及含量。结果显示:每种化妆品中防腐剂种类及配比均不同,以复合使用为主,可检出的防腐剂无超标现象,但防腐效果截然不同,可能有其他种类防腐剂存在。而微生物学方法可以直接评价化妆品的防腐效能,保证化妆品微生物安全。二、化妆品防腐效能评价方法的研究1.制备化妆品。为明确化妆品中防腐剂的含量,正确评价防腐剂效能,建立防腐效能评价标准方法,本次实验自行配制化妆品21份,包括空白样品1份和含不同种类、剂量防腐剂的化妆品20份。采用的防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、1,2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇、咪唑烷基脲和凯松,每种防腐剂设定4个剂量水平。所配制化妆品为膏霜类,pH值为6.5,经检测微生物指标合格。2.防腐效能评价用菌株的筛选。综合文献资料和前述化妆品微生物污染调查结果,本实验选取一批标准菌株,包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等,利用最小抑菌浓度的方法筛选出对防腐剂抵抗性较高,并包括革兰氏阴性、阳性细菌、霉菌和酵母菌至少各一株的一组微生物,作为防腐效能评价用菌株。根据实验结果确定以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿色假单胞菌、白色假丝酵母和黑曲霉进行化妆品防腐效能评价实验。3.防腐效能评价方法的建立。利用已筛选出的标准菌株对制备好的化妆品进行微生物挑战性实验,评价其防腐效能,并用保存和模拟使用实验验证评价结果的准确性,建立化妆品防腐效能评价标准方法。(1)微生物挑战性实验。采用混合培养和单一培养两种方式的微生物挑战性实验,分别于化妆品中加入10~8CFU/ml的混合微生物菌悬液和单一微生物菌悬液,于加菌的0、1、7、14、21、28天检测化妆品的菌落数,以此判断防腐剂的防腐效果。结果显示:单一培养微生物挑战性实验中,含防腐剂对羟基苯甲酸丙酯0.4%,凯松0.05%和O.1%,1,2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇0.05%的4份化妆品,在加菌第7天时,细菌菌落数都下降到99.9%,14天时真菌菌落数下降到99.0%,并且28天时无增长,通过挑战性实验,其余16份未通过挑战性实验。在混合培养微生物挑战性实验中,含防腐剂对羟基苯甲酸丙酯0.2%和0.4%,凯松0.01%、0.02%、0.05%、0.1%,1,2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇0.05%的7份化妆品,在加菌第7天时,细菌菌落数下降到99.9%,14天时真菌菌落数下降到99.0%,且28天时无增长,通过挑战性实验,其他13份化妆品未通过。空白样品未通过微生物挑战性实验。结果表明单一培养微生物挑战性实验较混合培养微生物挑战性实验对防腐效能的要求更高。(2)保存实验:制备好的化妆品于室温下密闭保存10个月,每两个月检测一次微生物指标。结果显示所有化妆品在保存过程中无微生物检出,少量的防腐剂即能抵抗保存过程中的轻微污染。(3)模拟使用实验:将制备好的化妆品随机分配给五名志愿者使用,定期检测微生物污染情况。结果显示20份含防腐剂的化妆品中,含防腐剂对羟基苯甲酸甲酯0.2%、0.4%,对羟基苯甲酸丙酯0.2%、0.4%,凯松0.02%、0.05%、0.1%,咪唑烷基脲0.3%、0.4%,1,2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇0.05%的10份化妆品无微生物检出,含凯松0.01%的1份化妆品检出细菌但未超标,9份微生物超标。模拟使用实验中微生物指标合格的化妆品与通过混合培养微生物挑战性实验的化妆品一致性较好,因此确定以混合培养微生物挑战性实验作为防腐效能评价方法。三、防腐效能评价方法实际验证利用混合培养微生物挑战性实验方法对15份市售化妆品进行防腐效能评价,并将通过的化妆品分别进行保存和模拟使用,验证防腐效能评价的结果。结果显示14份化妆品通过挑战性实验,并且通过挑战性实验的化妆品在模拟使用和保存的过程中微生物检测合格;1份未通过挑战性实验的化妆品在后期霉菌超标,证明了防腐效能评价方法的可行性。