研究背景：流行病学研究发现,我国食管癌高发地区林县人群维生素E (vitamin E, VE)和硒(selenium, Se)的缺乏是食管鳞癌的重要危险因素之一。在该地区进行的人群营养干预试验研究表明,联合补充VE和Se能够显著降低低年龄组人群食管癌的发病和死亡危险,而对高年龄组人群没有保护作用。其他干预试验发现,在已有食管组织严重异常增生的人群中补充抗氧化剂或其它营养素对食管癌和胃癌没有预防作用。上述研究结果提示,补充营养素可以降低食管癌的发生率和死亡率,但其预防作用可能只在食管癌的早期有效,而在癌变晚期可能没有预防作用。在利用营养素对食管癌的人群干预试验中,许多研究结果并不一致或备受争议,其主要原因是某些对癌症高危人群的干预研究结果不但没有观察到营养素的预防效果,反而有促进癌症发生的作用。因此,科学家提出一个新观点,认为营养素对癌症的化学预防作用可能具有“时间选择性”,即在癌症发生的不同阶段可能会有不同的干预效果,在癌变早期有效而晚期可能没有效果。这一推断与上述林县人群干预试验结果相符,然而该观点目前还缺乏试验证据,尚未得到很好的研究和结论。但是,关于补充营养素对癌症干预作用的时间选择性已经成为近年来癌症预防研究领域中广为关注的科学问题。鉴于早期在我国林县进行的VE和Se联合对食管癌的人群干预研究结果,以及两种营养素对人类营养和癌症预防的重要性,通过动物模型研究验证在食管癌早期和晚期补充VE和Se的干预效果,明确干预时间对食管癌化学预防的影响及潜在机制,不仅能进一步确证VE和Se的癌症预防作用,而且为阐明“补充营养素对癌症的干预作用可能存在时间选择性”这一重要观点提供科学证据,对于指导人类癌症的营养干预研究和实践具有重要意义。研究目的：(1)验证VE和Se缺乏能够促进食管癌的发生,而补充营养素则能够抑制癌症的形成,为证实营养素对癌症的化学预防作用提供进一步的科学证据；(2)阐明补充VE和Se对食管癌的干预作用是否存在时间选择性,验证林县人群营养干预试验的研究推论。研究方法：(1)利用N-甲基苄基亚硝胺(NMBzA)诱导的大鼠食管癌模型,初步探讨食管癌发生、进展的时间过程,为下一阶段进行食管癌早、晚期营养干预的试验研究提供依据。150只F344大鼠随机平均分为3组：模型组大鼠通过颈背部皮下注射给予NMBzA溶液(1.0mg/ml,溶剂为20%DMSO)染毒,模型组A染毒剂量为0.35mg/kg,模型组B染毒剂量为0.5mg/kg,染毒体积均为1.Oml/kg;对照组动物皮下注射给予20%DMSO。每周染毒三次,连续染毒5周(1～5周)。动物摄食量及体重每周测量记录1次,并根据动物每周体重调整注射体积。在实验第10和15周,每组各取10只动物麻醉处死,检查记录肉眼可见肿瘤的数量和大小；然后将食管以10%中性甲醛固定进行病理分析。实验第25周,剩余动物以相同方法解剖检查、固定、分析。将病理损伤程度划分为4个等级：单纯增生、异常增生、乳头状瘤和癌,对每个食管切片的各种病理损伤分别进行计数并统计。(2)利用大鼠食管癌模型模拟人群VE和Se营养缺乏状态,研究验证VE和Se缺乏对食管癌的促进作用,并初步探讨其是否存在“时间选择性”。190只F344大鼠随机平均分为5组,A～D组大鼠通过颈背部皮下注射给予NMBzA染毒(剂量0.35mg/kg), E组动物皮下注射给予20%DMSO为溶剂对照组。各组动物每周染毒三次,连续染毒5周(1～5周)。实验采用两种饲料进行营养干预：正常饲料中VE(α-生育酚)和Se含量分别为80IU/kg、0.15mg/kg;低VE/Se饲料中VE和Se含量分别为46IU/kg、0.05mg/kg,模拟林县人群VE和Se的营养缺乏状态。饲料干预方法：A组(低VE/Se组)0～25周给予低VE/Se饲料；B组(早期干预组)0～10周给予正常饲料,11～25周给予低VE/Se饲料；C组(晚期干预组)0-10周给予低VE/Se饲料,11～25周给予正常饲料；D组(全程干预组)0～25周给予正常饲料；E组(溶剂对照组)0～25周给予正常饲料。实验第5、10、15和25周,通过内眦插管从大鼠眼底静脉丛取EDTA抗凝血,分离血浆冻存留作VE和Se的检测。通过高效液相色谱法(HPLC)测定血浆中α-生育酚的含量,采用2,3-二氨基萘荧光法测定血浆Se含量。在实验第25周,将各组动物麻醉处死,观察记录肉眼可见肿瘤数量和体积。将食管纵向切分为两部分,一部分剥离保留粘膜层液氮冻存备用；另一部分以10%中性甲醛固定留作病理分析。通过BrdU免疫组织化学试验检测食管粘膜中的细胞增殖；血管内皮生长因子免疫组织荧光试验检测食管粘膜内微血管生成情况；Western blotting检测COX2、5LOX蛋白表达；酶联免疫试验检测组织中PGE2和LTB4水平；8-OHdG免疫组化检测DNA氧化损伤情况；采用GPx、GST酶联免疫试剂盒检测组织和血浆中抗氧化酶活性。(3)利用动物模型在食管癌不同阶段进行VE/Se补充干预试验,进一步证实“时间选择性”的研究假设并探讨其作用机制。240只F344大鼠随机平均分为6组,A～E组大鼠通过颈背部皮下注射给予NMBzA染毒(剂量0.35mg/kg), F组为溶剂对照组。各组动物每周染毒三次,连续染毒5周(1～5周)。实验采用3种饲料进行营养干预：正常饲料中VE(α-生育酚)和Se含量分别为80IU/kg、0.15mg/kg;低VE/Se饲料中VE和Se含量分别为46IU/kg、0.05mg/kg;局VE/Se饲料中VE和Se含量分别为162IU/kg、0.30mg/kg,模拟林县人群VE和Se的补充干预剂量。饲料干预方法：A组(低VE/Se组)0～25周给予低VE/Se饲料；B组(正常饲料组)0～25周给予正常饲料；C组(早期干预组)0～10周给予高VE/Se饲料,11～25周给予低VE/Se饲料；D组(晚期干预组)0～10周给予低VE/Se饲料,11～25周给予高VE/Se饲料；E组(全程干预组)0～25周给予高VE/Se饲料；F组(溶剂对照组)0～25周给予正常饲料。实验第5、10、15和25周,通过内眦插管从大鼠眼底静脉丛取EDTA抗凝血,分离血浆冻存留作VE和Se的检测。通过高效液相色谱法(HPLC)测定血浆中α-生育酚的含量,采用原子荧光法测定血浆Se含量。在实验第25周,将各组动物麻醉处死,观察记录肉眼可见肿瘤数量和体积。将食管纵向切分为两部分,一部分将粘膜层使用液氮冻存备用；另一部分以10%中性甲醛固定留作病理分析。通过BrdU免疫组织化学试验检测食管粘膜中的细胞增殖；Western blotting检测NFκB p65表达水平；RT-PCR检测食管组织中COX2、5LOX mRNA水平；酶联免疫试验检测组织中PGE2和LTB4水平、组织和血浆中8-OhdG水平；采用GPx、GST、SOD试剂盒检测组织和血浆中抗氧化酶活性。研究结果：(1)食管肉眼可见肿瘤：在实验第10周,模型组A、B动物食管内肉眼可见的肿瘤发生率均为50%,第15周分别增加至70%、80%。在实验第25周模型组B肿瘤发生率为100%,显著高于模型组A,同时显著高于其第10、15周肿瘤发生率。从第10周至15周,模型组A肿瘤体积迅速增加,至第15周时与模型组B肿瘤体积相近,显著高于第10周。从第15周至第25周,两模型组动物食管的平均肿瘤数量和体积均显著增加,显著高于第15周和第10周。组织病理学检查：在对照组动物中仅发现少量食管粘膜上皮的单纯增生,未见其他类型的病理损伤；在实验第10周,两模型组动物食管组织乳头状瘤发生率较低、数量较少,未发现上皮组织癌变。在实验第15周,两模型组中各有1只动物发生食管癌(10%)；动物模型组B动物食管粘膜的异常增生数量与第10周相比显著增加,且明显高于模型组A。在实验第25周,模型组B动物食管粘膜的乳头状瘤和癌的平均数量显著高于第10周。(2)一般情况：VE/Se缺乏及不同时间阶段的干预方式未对动物体重及摄食造成显著影响。营养监测：动物摄入低VE/Se饲料而使血浆VE和Se水平迅速降低,而晚期干预组(C组)在转换为正常饲料后则使血浆VE水平有所升高、Se水平显著升高。食管肉眼可见肿瘤及病理检查：低VE/Se组(A组)动物发生率为100%,早期干预组(B组,82.9%)、晚期干预组(C组,81.8%)和全程干预组(D组,71.8%)肿瘤发生率显著下降。早期干预(B组)和全程干预(D组)使动物食管荷瘤数以及异常增生、乳头状瘤、鳞状细胞癌的平均数量均显著减少,而晚期干预组(C组)荷瘤数、异常增生和乳头状瘤平均数量、乳头状瘤和鳞癌发生率与低VE/Se组(A组)相比均无显著性差异。对于肉眼可见肿瘤发生率、乳头状瘤发生率及平均数量、鳞癌发生率等主要指标,早期干预组与晚期干预组之间无显著性差异。细胞增殖：低VE/Se组(A组)大鼠食管组织的单纯增生、乳头状瘤和鳞癌等病理损伤中细胞增殖显著高于全程干预组(D组)。与VE/Se营养缺乏相比,早、晚期补充干预(B、C组)使食管鳞癌组织中细胞增殖显著下降,但其抑制效果显著低于全程干预(D组)。在异常增生和乳头状瘤组织中,早期干预组(B组)细胞增殖指数低于晚期干预组(C组),但差异无统计学意义。微血管生成：与低VE/Se组(A组)相比,全程干预(D组)使单纯增生、异常增生和乳头状瘤损伤中微血管的形成显著减少,早期干预和晚期干预也显示出抑制血管生成的作用,但二者间无显著性差异。COX2、5LOX蛋白表达：NMBzA染毒组(A-D组)大鼠食管组织中COX2和5LOX表达水平显著高于溶剂对照组(E组)。其中,低VE/Se组(A组)COX2及5LOX表达水平最高,显著高于其他染毒处理组(B-D组)；与低VE/Se组(A组)相比,早期补充干预(B组)和晚期补充干预(C组)均使COX2/5LOX表达水平降低,但二者与全程干预组(D组)之间无显著性差异。PGE2、LTB4水平：低VE/Se组(A组)和晚期干预组(C组)PGE2、LTB4水平均显著高于溶剂对照组(E组),而早期干预组(B组)和全程干预组(D组)与溶剂对照组(E组)无显著性差异。与晚期干预组(C组)相比,早期干预(B组)使动物食管组织中PGE2、LTB4水平减少更明显,但两组间差异无统计学意义。DNA氧化损伤：与低VE/Se组(A组)相比,全程干预(D组)使异常增生、乳头状瘤和鳞癌等病理损伤中8-OHdG阳性细胞数显著减少。早期干预组异常增生中阳性细胞比例(B组,32.7%)显著低于晚期干预组(C组,44.1%)。另外,早期干预组(B组)的乳头状瘤和鳞癌中阳性细胞比例也低于晚期干预组(C组),但差异无统计学意义。抗氧化酶活性：低VE/Se组(A组)大鼠食管组织GPx、GST及血浆GPx活性均显著低于全程补充干预组(D组)和溶剂对照组(E组)。晚期干预组(C组)与全程干预组(D组)相比无显著差异,而早期干预组(B组)食管GST活性、血浆GPx活性相对较低。早期干预组(B组)血浆GPx活性显著低于晚期干预组(C组),其余各项指标两组间无显著差异。(3)一般情况：VE/Se缺乏及不同时间阶段的补充干预未对动物体重及摄食造成显著影响。营养监测：在实验前10周,早期干预组(C组)和全程干预组(E组)大鼠摄入高VE/Se饲料,使血浆VE和Se水平明显升高,在实验第10周显著高于其余各组。自实验第11周以后,早期干预组(C组)动物因改为摄入低VE/Se饲料而使血浆VE和Se水平迅速降低,而晚期干预组(D组)在转换为高VE/Se饲料后则使血浆VE水平有所升高、Se水平显著升高。食管肉眼可见肿瘤：低VE/Se组(A组)动物食管肉眼可见肿瘤发生率为100%,显著高于其他染毒组；早期干预组(C组,64.1%)和全程干预组(E组,65.8%)肿瘤发生率均低于正常饲料组(B组,70.3%),但差异无统计学意义。晚期干预组肉眼可见肿瘤发生率(D组,86.5%)显著高于早期干预组(C组)和全程干预组(E组)。与低VE/Se组(A组)相比,正常饲料组(B组)、早期补充干预组(C组)和全程补充干预组(E组)动物食管荷瘤数、平均肿瘤体积显著减少,但晚期补充干预组(D组)荷瘤数与低VE/Se组(A组)相比无显著性差异。食管组织病理损伤检查：正常饲料组(B组)、早期补充干预组(C组)和全程补充干预组(E组)动物食管鳞状细胞癌的发生率、平均数量显著低于低VE/Se组(A组)和晚期补充干预组(D组)；而晚期补充干预组(D组)与低VE/Se组(A组)之间无显著差异。早期补充干预组(C组)和全程补充干预组(E组)乳头状瘤发生率和平均数量均低于晚期干预组(D组),但差异无统计学意义。早期干预组(C组)和全程干预组(E组)的异常增生数量显著低于晚期干预组(D组),而晚期干预组(D组)与低VE/Se组(A组)无显著差异。细胞增殖：正常饲料组(B组)、早期干预组(C组)和全程干预组(E组)动物食管组织单纯增生、异常增生和乳头状瘤等病理损伤类型中细胞增殖水平均明显低于晚期补充干预组(D组)。早期干预组(C组)与全程干预(E组)食管异常增生和乳头状瘤中细胞增殖指数无明显差异,二者均低于正常饲料组但无统计学差异。NFκB表达：早期干预组(C组)NFκB表达水平显著低于晚期干预组(D组),而晚期干预组(D组)与营养缺乏组(A组)相比无明显差异。与正常饲料组相比(B组),早期干预组(C组)与全程干预组(E组)NFκB表达水平均显著降低。COX2、5LOX的mRNA水平：低VE/Se组(A组)动物食管组织中COX2和5LOX的mRNA水平为溶剂对照组(F组)的5～14倍,显著高于正常饲料组(B组)和其他干预组；早期补充干预组(C组)COX2 mRNA水平显著低于晚期干预组(D组)和全程干预组(E组)；晚期干预组(D组)两种基因转录表达水平均与全程干预组(E组)无显著差异。PGE2、LTB4水平：早期干预组(C组)PGE2、LTB4水平与全程干预组(E组)相比无明显差异,但显著低于正常饲料(B组)和晚期干预组(D组)。DNA氧化损伤：低VE/Se组(A组)食管组织及血浆中8-OHdG水平与早期干预组(C组)无显著差异,但明显高于其他染毒处理组。早期干预组(C组)与晚期干预组(D组)相比血浆8-OHdG水平较高,但在食管组织中无显著差异。抗氧化酶活性：低VE/Se组(A组)大鼠食管组织GPx、SOD及血浆GPx活性均显著低于晚期干预组(D组)、全程补充干预组(E组)和溶剂对照组(F组),但是与早期补充干预组(C组)相比无显著差异(p>0.05)。早期干预组(C组)食管GPx、SOD及血浆GPx活性均显著低于晚期干预组(D组)和全程干预组(E组)。研究结论：(1)VE/Se缺乏能够显著促进NMBzA诱导的大鼠食管肿瘤的形成,补充正常水平的VE/Se能够抑制食管癌的发生但干预作用没有显著的时间选择性；(2)补充较高剂量的VE/Se对于大鼠食管癌的干预作用具有明显的时间选择性：早期干预对食管癌的抑制作用显著强于晚期补充干预,而晚期干预对动物食管癌的发生没有明显的预防作用。(3)氧化应激和花生四烯酸代谢异常可能是NMBzA诱发食管癌的重要作用机制。在癌变发生早期抑制氧化应激和NFκB介导的炎症反应,可能是补充VE/Se对食管癌产生“时间选择性”干预作用的重要机制。