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前言:肝细胞癌（肝癌,Hepatocellular Carcinoma）作为一种常见的恶性肿瘤严重地威胁着人类的健康[1-2]。肝癌的热消融治疗因其创伤小,疗效确切而广泛应用于临床。然而,肿瘤的局部复发是肝癌热消融治疗过程中所面临的最主要问题[3]。造成这一问题的原因可能源于以下两个方面:一:传统的热消融手段不可避免地具有热传导的非专属性与不均一性。二:瘤内异质性。近年来,纳米医学的飞速发展为肿瘤热消融治疗提供了新的思路,这其中最受到研究人员重视的就是光热消融[4-8]。肿瘤的光热消融是指通过具有光热转换性能的材料在肿瘤部位富集,在外加光源照射下,通过表面等离子共振效应（surface plasmon resonance）将光能转换为热能从而杀灭肿瘤细胞。此外,许多纳米材料均具有肿瘤的被动靶向作用。癌症组织血管组织学特性有别于正常组织,癌症组织血管结构紊乱,内皮细胞间距较大,基底膜不连续甚至缺损,目前认为这种现象是可能是由于癌症组织血管内皮生长因子和血管抑制因子失衡而引起[9]。因此,血液循环中的纳米材料会通过疏松的内皮间隙滞留聚集于肿瘤组织,这种现象被称之为“滞留增强阻滞效应”（enhanced permeability and retention effect,EPR effect）[10-11]。通过大量研究发现,粒径在100-400 nm的纳米材料EPR效应最为显著。由于具有良好光热转换性能的纳米材料能够在肿瘤组织特异性聚集以及外加光源（如近红外光）对正常组织没有损害,因此,光热消融最为突出的优势是在保证肿瘤组织得到热消融的同时,不损伤正常组织器官,从而提高了热消融的专属性。此外,光热消融是依赖于分布在肿瘤组织中的纳米材料,因此,光热消融在很大程度上提高了热消融的均一性。纳米材料因其具有多种形态以及丰富的化学基团,使其成为理想的化疗药物载体。负载化疗药物的纳米材料通过EPR效应聚集在肿瘤组织,可同时实现肿瘤的光热消融与靶向化疗,以期打破瘤内异质性所带来的治疗壁垒。二硫化钼纳米材料因其卓越的表面等离子共振特性,高的光热转换效能以及良好的生物相容性而成为理想的光热材料。在该研究中,我们首次合成出可用于静脉给药的中空片层二硫化钼纳米球,该纳米材料同时具有片层结构与中空结构,为负载化疗药物提供了更多的空间。我们通过真空负压载药法将多柔比星负载到该材料的片层结构与中空结构中,从而得到了负载多柔比星的中空片层二硫化钼纳米球（DOX@MoS2）。并将其用于肝癌的光热消融与靶向化疗。目的:本研究通过体外升温实验,药物缓释实验,体内外治疗实验,急性毒性评价等实验探索DOX@MoS2用于肿瘤光热消融与靶向化疗的可行性,以及通过光热消融与靶向化疗的协同治疗是否能够有效抑制肿瘤的局部复发。方法:1:中空片层二硫化钼纳米球的合成:硫脲与钼酸钠溶于去离子水与正丙醇的混合溶液中,用盐酸将上述溶液pH值调至3左右,溶液呈现浅绿色。将调好pH值的混合液至于超声雾化器中,一端通入氮气,使得雾滴随氮气气流进入600摄氏度电阻炉中发生反应。另一端以无水乙醇收集产物。2:负载多柔比星与药物缓释:二硫化钼纳米球和多柔比星分散于去离子水中,将该混合液至于超声分散机。使混合液处于真空环境,直至液体抽干。反应完成后,将产物用去离子水清洗最终得到负载多柔比星的中空片层二硫化钼纳米球（DOX@MoS2）。将DOX@MoS2分散于不同pH值的PBS中,置于37摄氏度恒温水浴摇床。在不同时间点小心收集上清液,并添加新的PBS。利用紫外分光光度计测量不同时间点上清液中的药物浓度。3:DOX@MoS2光热性能:将不同浓度的DOX@MoS2水溶液用近红外光照射并用红外热测绘仪实时记录温度变化,以水作为对照组。4:体外治疗实验（1）分组:A组:MoS2+NIR辐照B组:DOX+NIR辐照C组:DOX@MoS2+NIR辐照D组:PBS对照组（2）实验过程:96孔板内分别加入HepG-2细胞,使每孔细胞数为8×103,培养24h。之后分别加入100μLMoS2,DOX,DOX@MoS2及PBS,DOX浓度为100μg/mL。每组设置三个复孔。2h后用PBS小心冲洗,再加入新的培养液。随后,用不同功率（0.4,0.8,1.2W/cm2）的808nmNIR进行辐照。PBS对照组不施加光照。随后,每孔加入20μL MTT溶液。4h后,每孔加入150μL DMSO,适当摇动96孔板。酶标仪检测OD值,检测波长为492nm。5:DOX@MoS2体内治疗实验取16只雌性荷瘤小鼠,随机分成如下四组:A组:静脉注射DOX组;B组:静脉注射MoS2+NIR辐照组;C组:静脉注射DOX@MoS2+NIR辐照组;D组:静脉注射生理盐水。注射剂量为:DOX为10mg/Kg,MoS2,DOX@MoS2为40mg/Kg。静脉注射12h后,用808nm,1.2W/cm2的NIR辐照三分钟。每天记录小鼠体重与肿瘤体积。肿瘤体积计算方式为:V=1/2AB2,A为肿瘤长径,B为短径。观察周期为15天,小鼠肿瘤长径超过20mm时,将其处死。小鼠死后取主要脏器（心,肝,脾,肺,肾）进行组织学观察。6:急性毒性评价取12只雌性小鼠随机分成如下四组:A组:静脉注射DOX@MoS2,50mg/Kg.B组:静脉注射DOX@MoS2,100mg/Kg。C组:静脉注射DOX@MoS2,200mg/Kg。D组:PBS对照组。注射完成后,正常进食,饮水。20天后处死。获取血液进行血常规与血生化检验。结果:利用扫描电子显微镜以及透射电子显微镜观察所得到的纳米材料:扫描电子显微镜下可见大小,形貌均一的球形结构,分散均匀,形态规整。高倍透射电子显微镜下可见,球形结构内部中空,无杂质,并可见球形结构外壁由多片层结构构成,该结构为二硫化钼最具特征性的结构。以上结果表明,已成功合成出中空片层二硫化钼纳米球。对该纳米材料进行粒度分析表明,该材料的粒径为300nm左右。通过多柔比星紫外标准曲线（纳米材料可控制备与应用实验室2016版）可得,通过真空负压载药法的载药率为32.5%。DOX@MoS2在酸性条件下释放量较多,在pH=5.0的条件下,12h（720min）释放量达到35%,在12h之后略有增高。而在pH=7.4的条件下,12h（720min）释放量仅为12.5%,即便是24h（1440min）也仅为13%。DOX@MoS2的升温情况呈现出明显的浓度依赖性,在808 nm,2.0 W/cm2近红外光照辐照下,1mg/m L组在5min达到了59℃,高出水对照组接近26℃,即便是0.25mg/m L组在5min亦能达到45℃以上。经DOX@MoS2处理的HepG-2细胞,细胞活性随着经红外光功率增高呈现明显减低,DOX@MoS2组细胞活性在0,0.4,0.8,1.2W/cm2的情况下分别为75.0±5.5%,50.5±3.2%,33.4±2.4%,以及27.8±1.9%。尽管MoS2组表现出相同趋势,但其明显弱于DOX@MoS2组。DOX组几乎不受近红外光功率变化的影响。在0—1.2 W/cm2的条件下,细胞活性分别为63.7±4.6%,44.5±3.3%,46.3±8.2%和42.8±4.3%。DOX@MoS2组小鼠肿瘤得到完全治愈,未见复发。对照组,DOX组,以及MoS2+NIR组的肿瘤体积分别为1325.8±100.4,736.4±169.6,248±77.8mm3。各项血生化与血常规指标均未见明显异常。结论:1:本研究成功地合成出可用于静脉注射的中空片层二硫化钼球,并成功地进行化疗药物负载（DOX@MoS2）。2:DOX@MoS2具有良好的生物相容性。3:DOX@MoS2用于肿瘤的光热消融与靶向化疗,可有效抑制肿瘤的局部复发。