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棉铃虫核型多角体病毒是我国第一个商品病毒杀虫剂,具有使用安全,害虫不产生抗性等优点,是一种很有发展潜力的可替代生物农药。目前中国棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒（HaSNPV）的基因组序列已经测序完成,在HaSNPV基因组中发现了18家族几丁质酶的序列,该几丁质酶基因是一个晚期非必需基因。由于HaSNPV几丁质酶基因与受染虫体液化和病毒侵染机制密切相关,因而该基因的研究日益引起了人们的重视。 在本研究中我们将删除了N端20个氨基酸的信号肽和C端4个氨基酸的内质网定位序列的HaSNPV几丁质酶基因构建到高效原核表达载体pET28a（+）中,经测序检验后,转化表达宿主菌Rosetta（DE3）,以IPTG为诱导剂诱导表达。最佳IPTG诱导浓度为0.5mM,最佳诱导时间为3h以上,（His）6-chiA蛋白可占总蛋白的22.6%,1mL菌液约含（His）6-chiA蛋白65μg,但是（His）6-chiA蛋白主要以包涵体的形式表达。为了得到可溶性蛋白,我们还将HaSNPV的几丁质酶基因构建到pMAL-c2X载体中,pMAL载体特别有利于外源蛋白的正确折叠,从而形成可溶性的蛋白。MBP-chiA融合蛋白可占总蛋白的14.7%,1mL菌液约含MBP-chiA蛋白47μg,而可溶性的MBP-chiA蛋白占到总MBP-chiA蛋白的30%以上。虽然依旧没有获得有活性的蛋白,但为进一步的研究奠定基础。 在本研究中我们大量培养含有pET28a（+）-chiA质粒的Rosetta（DE3）,诱导表达,收集包涵体蛋白,对其进行初步洗涤纯化,然后用8M尿素溶解,在变性条件下（8M尿素）经镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）柱进行亲和层析纯化,得到的电泳纯的重组几丁质酶蛋白,纯度可达95%以上。然后,我们采用了逐步透析的方法对电泳纯的包涵体蛋白进行复性,于4℃分别对100mL尿素浓度依次为6M-5M-4M-3M-2M-1M-0M的透析液进行透析,每组透析液透析12h,复性效率为28%,1mg复性后蛋白的活性为0.3U。我们也采用了柱上复性的方法对包涵体进行复性,依次以含有6M-5M-4M-3M-2M-1M-0M尿素的refolding buffer的缓冲液洗柱,得到了活性重组几丁质酶蛋白,复性效率约为43%,1mg复性后蛋白的活性为0.5U,此方法可实现蛋白的同时纯化及复性。