研究背景及意义：阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)是耳鼻喉科一种常见的睡眠呼吸障碍疾病。咽喉气道狭窄或者肌肉松弛是其主要原因,患者表现为夜间睡眠过程中反复发生上气道阻塞或塌陷,导致低通气或者呼吸暂停,从而引起低氧血症或者高碳酸血症等。其发病机制复杂,可并发多种疾病,具有严重的潜在危险性。既往临床上治疗OSAHS的方法包括手术及药物治疗,根据学者们的研究发现,并非所有的OSAHS患者都可以通过手术来解决问题的,Frideman[3]分级可以有效预钡OSAHS患者的手术结果从而指导治疗,对于Frideman分级为I期的患者,手术疗效可以达到80.6%,II期的患者手术疗效为37.9%,而Ⅲ期的患者手术疗效直接降至8%,故对于分级为Ⅲ、Ⅳ期的患者来说,手术是毫无意义的。那么对于这一类无法通过手术治疗的Frideman Ⅲ、Ⅳ期的OSAHS患者来说,目前最为推崇的经典而有效的方法为持续气道正压通气(continuous positive airway pressure,CPAP),但是由于CPAP需要患者每晚佩戴面罩并且有噪音等,严重影响患者及家属的休息,所以即使疗效显著,也依然难以被广大患者所接受,拒绝接受CPAP治疗的患者百分比竟高达40-50%。直至21世纪初,随着对OSAHS的发病机制、解剖学研究的不断深入了解及探讨,加之实验室诊疗设备的迅猛发展,舌下神经刺激(hypoglossal nervestimulation,HGNS)于2001年开始进入临床试验,但至今仍未能应用于临床。在更早期,Miki等在20世纪80年代初就行了相关研究,他应用针刺电极,刺激清醒状态下的实验犬的颏舌肌,并证实,刺激上气道扩张肌能稳定及增大咽腔,进而达到治疗OSAHS的目的。颏舌肌,是最重要的上气道扩张肌,起于上颏棘,扇形的肌纤维,向后分散,大部分肌纤维止于舌尖、舌背,少量止于舌骨体的前上缘,主要负责舌之运动,颏舌肌收缩可牵拉舌体向对侧偏移以及向前运动,从而扩大咽腔,维持上气道开放,故颏舌肌也被美称为上气道的“安全肌”。当颏舌肌的功能下降,无法抵抗上气道吸气负压时,可致口咽气道塌陷,进而引起睡眠呼吸暂停或低通气。而颏舌肌虽是骨骼肌,却又与一般的骨骼肌不尽相同,与其他骨骼肌相比,颏舌肌的血供丰富,肌纤维含量相对较少,收缩也更迅速,所以更易发生松弛和疲劳,不适合持续而强烈的收缩。所以临床上可以通过功能性的电刺激颏舌肌,使其规律收缩,达到治疗OSAHS的目的。目前对颏舌肌进行肌肉电刺激的研究也仅仅限于实验室,Odeh等对已麻醉的实验犬的咽部扩张肌进行研究后,发现刺激颏舌肌的机械效应相对于刺激其他肌肉更显著,并且与头位无关。Oliven等人则通过研究发现,刺激舌下神经和刺直接刺激犬的颏舌肌所产生的结果相近。因此,用于治疗OSAHS的肌肉起搏器应运而生。众所周知功能性电刺激(functional electrical stimulation FES)在其他领域已得到广泛应用并获得成功,如心脏起搏器、膈肌起搏器以及膀胱逼尿肌起搏器等,应用于我们耳鼻咽喉科的电刺激器目前主要有喉起搏器,作为一种新兴的治疗发展方向,肌肉起搏器是一种功能性肌肉刺激器,起搏后可刺激肌肉并使之恢复活动的技术。最早由美国的Zealear与Dedo等人第一次将这个概念应用于我们喉科,在一定的实验室基础上,1996年Zealeal首次将喉起搏器用于人声带麻痹的治疗,并且他成功证实了,应用于失神经支配的狗的环杓后肌并使之运动的肌肉起搏器的刺激参数,同样适用于人的喉内肌刺激。随着肌肉起搏器的应用日渐增多,有关电刺激对肌肉的影响的研究也越来越多。肌卫星干细胞作为肌肉再生及修复的重要来源,位于基底膜中,与众多干细胞一样,肌卫星干细胞也具有不稳定性,在不同参数的电刺激下,肌卫星干细胞可能会发生分化、增殖或者凋亡,我们前期的实验已经确定了能够促进卫星干细胞增殖的电刺激参数。肌卫星干细胞是一种多潜能干细胞,在骨骼肌的损伤、修复和维持中起着十分重要的作用。然而正常情况下,肌卫星干细胞是处于静止状态的,只有当肌肉受到损伤,例如失神经支配、缺氧、牵拉或电刺激时,肌卫星干细胞才会被激活,从而开始增殖分化。肌卫星干细胞被激活后开始增殖的机理十分复杂,电刺激下肌卫星干细胞进行增殖是通过何种信号通路进行调节的目前仍尚未清楚。国内外关于该方面的研究也较局限。目前体内实验发现NO/HGF/c-met通路可能参与其信号通路,而促进肌卫星干细胞增殖的其他细胞内在通路如Wnt通路、Sphingolipid信号通路、Notch信号通路均未见有研究。本研究拟对以上三个体外信号通路进行研究,以期发现一定的电刺激促进肌卫星干细胞增殖的主要作用通路,进而为临床肌肉起搏器的研发提供一定的实验室基础。目的：以小鼠肢体来源的C2C12细胞系及原代培养的幼年比格犬颏舌肌卫星干细胞为研究对象,通过固定电压、固定刺激时间、固定脉宽,不同频率的脉冲电刺激培养细胞,从而了解不同模式电刺激下C2C12细胞系以及肌卫星干细胞的增殖和分化情况,进一步筛选出肌卫星干细胞的电刺激调控的增殖信号通路。方法：1.取体外培养的肌源性C2C12细胞株, 采用固定电压(5V)、固定刺激模式、不同频率(OHz、10Hz、80Hz三组)的串刺激(5s,3s-on,2s-off)刺激细胞72小时,并提取细胞RNA,经过逆转录后,运用qRT-PCR(Quantitative Real-time PCR)观察细胞增殖情况,从而筛选出电刺激下C2C12细胞增殖的信号通路。2.分别用0.25%的胰蛋白酶消化提纯以及Percoll密度梯度离心法两种方法分离提纯比格犬颏舌肌原代肌卫星干细胞,并用免疫荧光法分别对两组原代培养的肌卫星干细胞进行鉴定；采用固定电压(5V)、固定刺激模式、不同频率(0Hz、80Hz三组)的串刺激(5s,3s-on,2s-off)刺激肌卫星干细胞72小时,提取细胞RNA及蛋白,使用qRT-PCR及Western Blot定量／半定量细胞增殖相关分子的表达情况,进而筛选出肌卫星干细胞电刺激影响的增殖的信号通路。2.用SPSS 19.0统计软件进行分析。采用独立样本T检验分析了解固定刺激电压、刺激模式,不同刺激频率的串刺激下,肌卫星干细胞的增殖情况。以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.原代培养的比格犬颏舌肌卫星干细胞纯度达80%以上。2.C2C12细胞系：在固定电压(5V)、相同脉宽(1ms)、刺激时间相同的串刺激(5s,3s-on,2s-off)下,刺激频率为80Hz时, 分化信号分子MyoD和Myc,Wnt信号通路中的分子Cyclin D1、rfz、mfz1、mfz2、mfz3、mfz、mfz6、mfz7、 mfz8及Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、Wnt8、Wnt10、Wnt11、lef-1、dvl-1等mRNA相对表达量减少；而Timp1、Timp3及β-catenin的表达量相对增加。10Hz及80Hz时Notch通路的Notch1、Notch2、Notch3、HERP、DEC的mRNA相对表达量增加；Sphingolipid信号通路Sphk1、Sphk2、Sgp11、Slpr1、Slpr2、Slpr5、cadherin、 Pax7的mRNA相对表达量也相应增加。3.颏舌肌卫星干细胞：在固定电压(5V)、相同脉宽(1 ms)、刺激时间相同的串刺激(5s,3s-on,2s-off)下,刺激频率为80Hz时,qRT-PCR结果显示肌卫星干细胞并未出现增殖；在低频刺激10Hz时,肌卫星细胞组中,Sphingolipid信号通路中pax7、sgp11、sgpp1、slpr2、slpr3、slpr4、sphk1、sphk2、cadhenin、的mRNA相对表达量相应增加。实验组及对照组中Pax7灰度比无差别；MyoD的灰度0Hz组是最高,其次是80Hz组,最低为10Hz组。结论：PERCOLL非连续密度梯度离心法提纯的原代培养的比格犬颏舌肌卫星干细胞纯度较高。在固定电压、相同脉宽以及刺激时间相同的串刺激下,颏舌肌卫星细胞对高频、低频电刺激的反应不同于C2C12,后者在低频、高频的电刺激时表现为增殖增加,而前者在低频、高频的电刺激下,分化能力减弱；不同频率的电刺激通过激活了Wnt、Notch、Sphingolipid等三个信号通路使C2C12细胞进入增殖；而在不同频率电刺激下颏舌肌卫星细胞的总体趋势是分化减弱,这可能是低频刺激时Notch通路减弱及Sphingolipid增强同时存在的结果,高频电刺激时,颏舌肌卫星细胞分化减弱,是Notch和Sphingolipid通路同时抑制的结果。