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目的:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代谢性疾病累及肝脏的主要病症,是2型糖尿病的重要合并症。炎症、免疫、胰岛素抵抗、氧化应激、凋亡及内质网应激等多种机制均参与到NAFLD发展之中。其中,炎症在NAFLD发生和进展中发挥重要作用,并且NAFLD的病理表现与肝脏巨噬细胞沉积及极化有密切关系。DPP-4抑制剂,作为临床已广泛应用的新型降糖药物,通过促进肠促胰素的产生而促进胰岛素分泌,发挥葡萄糖依赖的降糖效果。近来研究,二肽基肽酶-4(DPP-4)是介导免疫和炎症反应的关键因子,故有研究表明DPP-4抑制剂还可能通过其他作用机制发挥胰腺外治疗作用。目前,DPP-4抑制剂对NAFLD作用报道很少且作用机制尚未完全阐述清楚,而沙格列汀作为DPP-4抑制剂家族的一种,在NAFLD中的作用机制尚未涉足。因此,基于DPP-4的炎症介导作用,我们通过构建动物模型、培养细胞进行体内外实验、应用多种实验技术,研究沙格列汀是否通过抑制肝脏炎症反应而起到改善NAFLD作用。并且探讨沙格列汀是否通过影响肝脏巨噬细胞的沉积及极化来起到抗炎作用。此外,我们进一步研究沙格列汀通过何种信号通路调控巨噬细胞极化并影响肝脏炎症反应。方法:1、体内动物实验:选择清洁级Sprague–Dawley(SD)大鼠构建糖尿病病理模型,总数量为45只。普通饲料饮食适应性喂养1周后,从中随机选取15只继续予普通饲料喂养,作为实验正常对照组。其余30只则予高脂饮食,持续喂养10周后测体重、血糖、血脂水平,并进行IPGTT实验。然后以单次小剂量STZ注射构建2型糖尿病模型。随机选取15只造模成功的SD大鼠给予沙格列汀口服灌胃,干预时间为12周,对照组则给予同体积的生理盐水灌胃12周,并以此分为:正常对照组(NC组)、模型对照组(DM组)和沙格列汀干预组(DM+SAX组)。12周末,记录体重、血糖,处死并立即留取标本。随后,应用苏木素-伊红(H&E)染色技术进行大鼠肝组织形态学观察;应用甘油三酯(TG)及总胆固醇(TC)试剂盒检测肝组织TG和TC含量;应用DPP-4酶试剂盒测定肝组织中DPP-4酶活性;采用免疫组织化学染色检测肝组织切片中NF-кB、TNF-α、IL-1β的表达;借助免疫荧光染色法观察肝组织切片DPP-4、CD68、iNOS、CD206的表达情况;应用qRT-PCR检测NF-кB、TNF-α、IL-1βmRNA表达水平;采用Western Blotting法检测DPP-4、NF-кB、TNF-α、IL-1β、IL-6、CD68、iNOS、CD206、CaMKKβ、p-AMPK蛋白质表达水平。2、体外细胞实验:人THP-1单核细胞系是研究巨噬细胞最常用的模型之一,首先,给予50ng/ml佛波酯(PMA),使THP-1单核细胞分化为M0型巨噬细胞,再以脂多糖(LPS)和IL-4使M0型巨噬细胞各自诱导为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。利用免疫荧光染色法检测M1型(iNOS)、M2型(CD206)表型标记,确定两种巨噬细胞是否诱导分化成功。加入沙格列汀(5μmol/L)和CaMKKβ抑制剂STO-609(10μM)进行分组干预,通过Western Blotting法检测p-AMPK、NF-кB、TNF-α、CD206指标,初步探讨沙格列汀通过CaMKKβ/AMPK调控巨噬细胞极化所介导的炎症反应作用。结果:1、SD大鼠分别经普通和高脂饮食干预10周末,高脂饮食组体重和血脂水平都明显增加(P<0.05),血糖水平升高但尚无明显差异(P>0.05)。IPGTT显示高脂饮食组糖负荷后各时间点血糖均明显高于普通饮食组,且计算所得曲线下面积(AUC)也显著增加(P<0.05)。2、药物灌胃12周后,与NC组相比,DM组和DM+SAX组大鼠的血糖和血脂水平明显升高(P<0.05);而与DM组相比,沙格列汀干预组血糖、血脂水平降低但未发生明显改变(P>0.05)。此外,此三组大鼠肝功能无显著差异(P>0.05);DM组肾功能指标BUN相比NC组显著性升高,而沙格列汀干预后相比DM组显著下降(P<0.05)。3、H&E染色观察各组大鼠肝组织形态学改变:光镜下NC组肝小叶结构规整,肝细胞形态大小均一,围绕中央静脉放射状排列呈索状;DM组则表现为肝小叶正常结构紊乱,肝细胞体积增加,且细胞内有大量脂滴沉积,呈空泡样变,肝索消失;而DM+SAX组显示,肝细胞排列较DM组明显整齐,肝索重新出现,细胞内脂滴显著减少。4、各组大鼠肝组织脂质含量差异:DM组TG和TC含量显著多于NC组(P<0.05),加入沙格列汀后TG和TC含量明显下降(P<0.05)。5、各组大鼠肝组织DPP-4活性和DPP-4含量比较:与NC组相比,DM组DPP-4活性明显增加(P<0.05);而沙格列汀干预后DPP-4活性则显著降低(P<0.05)。另通过免疫荧光技术和Western Blotting法从蛋白水平比较DPP-4表达含量差异,DM组DPP-4蛋白水平相比NC组明显增加(P<0.05),而DM+SAX组DPP-4蛋白表达量显著减少(P<0.05)。6、各组大鼠肝组织炎症因子表达水平差异:应用免疫组织化学染色法,发现与NC组相比,DM组NF-кB、TNF-α、IL-1β表达水平明显增加;与DM组相比,DM+SAX组上述炎症因子表达减少。另外应用qRT-PCR、Western Blotting法检测炎症因子mRNA水平、蛋白水平差异,发现在DM+SAX组,以上指标表达量较DM组均明显降低(P<0.05)。7、各组大鼠肝组织巨噬细胞浸润情况及巨噬细胞表型差异:应用免疫荧光染色技术显示,与NC组相比,DM组中总巨噬细胞标记CD68、M1型巨噬细胞标记iNOS表达水平明显增强,M2型巨噬细胞标记CD206水平却明显减少;而DM+SAX组相比于DM组CD68、iNOS表达显著减少,CD206水平显著增加。另应用qRT-PCR、Western Blotting法在mRNA水平和蛋白水平亦表现为与免疫荧光染色技术相同的显著趋势(P<0.05)。8、各组大鼠肝组织CaMKKβ/AMPK表达含量差异:应用Western Blotting法检测CaMKKβ和p-AMPK蛋白表达水平,与NC组相比,DM组CaMKKβ和p-AMPK表达显著减少(P<0.05);而DM+SAX组相比于DM组,CaMKKβ和p-AMPK的蛋白表达量明显增加(P<0.05)。9、M1/M2型巨噬细胞诱导分化:THP-1单核细胞经PMA分化为M0型巨噬细胞,观察不同PMA浓度刺激下,发现THP-1细胞在50ng/ml和100ng/ml PMA诱导分化48小时后,细胞贴壁、形态不规则且伸出伪足数量较多,为避免过量PMA对细胞的毒性作用,故选择50ng/ml PMA作为巨噬细胞分化条件。另外以1mg/ml LPS和40ng/ml IL-4分别诱导M1和M2型巨噬细胞,经免疫荧光染色显示,PMA+LPS组中iNOS表达显著高于PMA组;而PMA+IL-4组中CD206表达亦显著高于PMA组,因此可认为M1和M2型巨噬细胞诱导成功。10、沙格列汀对CaMKKβ/AMPK介导的M1/M2型巨噬细胞炎症反应影响:应用Western Blotting法,分别检测沙格列汀和(或)STO-609干预下M1型巨噬细胞中p-AMPK、NF-кB和TNF-α以及M2型巨噬细胞中p-AMPK和CD206蛋白表达水平。在M1型和M2型巨噬细胞中,沙格列汀均使p-AMPK表达显著增加,当加入STO-609后,p-AMPK表达又明显被抑制(P<0.05);另外在M1型巨噬细胞沙格列汀干预下,NF-кB和TNF-α表达显著减少,同时加入STO-609后,二者表达又明显增加(P<0.05);而M2型巨噬细胞中,沙格列汀使CD206水平明显增加(P<0.05),加入STO-609后,CD206水平有下降趋势,但尚未达到统计学差异(P>0.05)。结论:1、沙格列汀可以改善糖尿病大鼠NAFLD脂肪样变性。2、沙格列汀可通过发挥降糖作用之外的抗炎作用减轻NAFLD炎症反应。3、沙格列汀可以调控巨噬细胞的极化,抑制促炎M1型巨噬细胞并促进抗炎M2型巨噬细胞。4、沙格列汀可能通过CaMKKβ/AMPK调控巨噬细胞,且主要是通过此途径抑制促炎M1型巨噬细胞的作用。