研究背景:据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计,癌症是全球第二大死亡原因,2018年全球约有960万人死于癌症[1]。国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer,IARC)最新发布的数据显示,胃癌位居全球癌症新发病例第五位、致死病例第三位[2]。据中国国家癌症中心统计,胃癌是我国发病率第二位、致死率第三位的恶性肿瘤[3]。在临床诊疗中,癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、糖类抗原 19-9(carbohydrate antigen 19-9,CA19-9)等分子标志物己应用于胃癌的临床辅助诊断,但特异性欠佳[4]。早期胃癌治疗多采用内镜下切除,进展期胃癌多采用开腹手术或腹腔镜手术切除,并联合术后辅助化疗。此外,放射治疗、射频消融、腹腔灌注及动脉介入栓塞灌注等局部治疗手段应用日益增多,然而胃癌患者整体预后仍不容乐观。近些年,分子靶向药物治疗和免疫药物治疗等新兴手段备受关注,但以HER2为靶点的帕妥珠单抗(Pertuzumab)和抗血管生成的雷莫芦单抗(Ramucirumab)等分子靶向药物在胃癌方面的疗效并没有确切的研究报道,以抗程序性死亡受体-1(Programmed death-1,PD-1)的派姆单抗(Pembrolizumab)为代表的免疫治疗药物在胃癌治疗获益人群中尚存争议[5]。因此,继续深入探究胃癌演进的相关调控基因及其分子作用机制,对于胃癌早期诊断、靶向治疗及改善预后具有重要的临床意义。T 淋巴瘤转移侵袭诱导因子 1(T-cell lymphoma invasion and metastasis-inducing factor 1,Tiam1)由 Habets 等于 1994 年从鼠 T 淋巴瘤中分离出来。人Tiam1基因定位于21号染色体的q22.1[6]。正常情况下,Tiam1在人脑组织和睾丸中相对高表达,在支气管黏膜上皮、肝细胞、心肌等组织低表达,在其他组织中基本不表达。现有研究表明,Tiam1在肿瘤的演进过程中具有双重性(促癌作用与抑癌作用):有报道发现Tiam1在肺腺癌[7]、食管鳞癌[8]、胰腺癌[9]、甲状腺癌[10]等组织中高表达,促进肿瘤演进,并与患者的不良预后密切相关。也有研究发现Tiam1在结肠癌中高表达并抑制肿瘤的演进[11]。这些研究提示,Tiam1可能参与了多种肿瘤的发生、发展过程,但其在肿瘤演进中的具体机制有待于进一步研究。我们的前期研究发现,Tiam1在胃癌组织中高表达,且其高表达预示胃癌患者的不良预后,但其参与调控胃癌演进的分子机制目前仍不明确,有关Tiam1与胃癌临床病理参数之间的关系仍需扩大病例进行深入探讨与验证。研究目的:(1)探究Tiam1在胃癌中的表达情况,分析Tiam1在胃癌中高表达与胃癌临床病理参数、患者预后之间的相关性;(2)阐明Tiam1对胃癌细胞增殖、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程以及血管生成等生物学功能的影响;(3)初步揭示Tiam1调控胃癌演进的相关分子机制,为胃癌的早期筛查和预后改善提供可能的有效分子靶点。材料与方法:材料:使用人胃黏膜细胞系GES-1,人胃癌细胞系AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN-45、MKN-28,人脐静脉内皮细胞系 HUVEC,人淋巴内皮细胞系HLEC等多个细胞系;收集209例石蜡标本及芯片,包括153例胃癌组织和56例癌旁组织;收集胃癌患者新鲜组织标本70例,包括10对早期胃癌及癌旁新鲜组织标本共20例,10对中期胃癌及癌旁新鲜组织标本共20例,10组发生淋巴结转移的晚期胃癌、癌旁及淋巴转移灶新鲜组织标本共30例。方法:(1)应用数据库信息检索分析Tiam1在胃癌组织中的表达情况,并通过免疫组织化学染色、HE染色和蛋白免疫印迹实验(Western blot)等方法进一步验证:分别检索Human Protein Atlas数据库、cBioPortal数据库、Oncomine数据库、GEO数据库,分析胃癌组织中Tiam1的表达情况;应用Western blot、HE染色和免疫组织化学染色检测70例新鲜组织标本中Tiam1的表达情况;应用免疫组织化学染色方法检测209例石蜡及组织芯片标本中Tiam1的表达情况,并分析其与临床病理参数的相关性;检索Kaplan-Meierplotter数据库信息,分析Tiam1的表达与胃癌患者生存期的关系。(2)应用慢病毒转染、克隆、划痕、迁移与浸润等实验方法,检测Tiam1对胃癌细胞增殖、转移、侵袭、血管生成等分子生物学功能的影响:应用Western blot检测Tiam1在多种胃癌细胞系中的表达水平,运用慢病毒转染技术建立Tiam1表达下调的AGS/sh-Tiam1细胞系和Tiam1高表达的MKN-45/ex-Tiam1细胞系;应用噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)实验、平板克隆实验,检测Tiam1差异表达对胃癌细胞增殖能力的影响;应用划痕实验、迁移实验和浸润实验,检测Tiam1差异表达对胃癌细胞迁移、浸润能力的影响;应用Western blot和人脐静脉细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)以及人淋巴内皮细胞(Human lymphatic endothelial cells,HLEC)微管形成实验,检测Tiam1差异表达对血管生成能力的影响。(3)应用Western blot、免疫荧光和微管形成等实验方法,通过信号通路抑制剂处理,从正反两方面探究Tiam1参与胃癌细胞EMT进程和调控PI3K/AKT/mTOR信号通路的机制:应用Western blot和免疫荧光实验,检测Tiam1差异表达后EMT相关标志物的变化;应用Western blot检测Tiam1差异表达后PI3K/AKT/mTOR信号通路相关标志物的变化;之后进行反向验证,应用PI3K/AKT/mTOR信号通路特异性抑制剂LY294002和Rapamycin对Tiam1高表达的MKN-45/ex-Tiam1细胞系进行处理,检测处理后PI3K/AKT/mTOR信号通路相关标志物的变化;通过划痕实验、迁移实验、浸润实验、HUVEC微管形成实验、HLEC微管形成实验等检测细胞迁移浸润能力及血管生成的变化;应用免疫荧光实验和Western blot检测经抑制剂LY294002和Rapamycin处理后EMT相关标志物的变化。结果:(1)多个数据库分析显示Tiam1在胃癌组织中高表达:Human Protein Atlas数据库显示Tiam1在胃癌组织中的mRNA表达水平显著上调,在80%以上的胃癌患者中均呈高表达;cBioPortal数据库显示Tiam1在胃癌组织中呈高表达,Oncomine数据库的分析结果与之相一致(P<0.05);GEO数据库显示Tiam1在胃癌组织中的mRNA表达水平亦显著高于癌旁组织(P<0.01)。(2)Tiam1在胃癌中高表达,且与淋巴结转移、浆膜浸润等临床病理学参数密切相关:①70例新鲜组织标本的Western blot结果显示:Tiam1在胃癌组织中的表达水平明显上调,HE染色及免疫组织化学染色结果与之一致。其中,在10对早期、10对中期、10对晚期胃癌组织中Tiam1表达均显著高于癌旁正常组织(P<0.01);在10例发生淋巴转移的患者中(每例患者取癌、癌旁和淋巴结转移灶三部分组织),检测结果表明,Tiam1在胃癌组织和淋巴转移灶中的表达均显著高于癌旁正常组织(P<0.01);进一步分析发现,Tiam1在30对胃癌组织中的表达均显著高于癌旁正常组织,在晚期胃癌组织中的表达高于早期胃癌组织,在发生淋巴结转移的胃癌组织中表达高于未发生淋巴结转移的胃癌组织(P<0.01)。②209例石蜡标本及组织芯片免疫组织化学染色结果显示:Tiam1在胃癌组织中阳性率为 86.3%(132/153),显著高于癌旁正常组织(35.7%,20/56)(P<0.01),强阳性率为66.7%(102/153),显著高于癌旁正常组织(10.7%,6/56)(P<0.01)。进一步分析Tiam1与临床病理参数之间的关系发现,Tiam1在中低分化的胃癌患者中的强阳性率为79.8%(87/109),显著高于高分化的胃癌患者(34.1%,15/44)(P<0.01);Tiam 1在临床分期Ⅱb-Ⅲc的胃癌患者中的强阳性率为75.8%(72/95),显著高于临床分期Ⅰ-Ⅱa的胃癌患者(51.7%,30/58)(P<0.01);在有淋巴结转移的胃癌患者中强阳性率为74.7%(68/91),显著高于无淋巴转移胃癌患者(54.8%,34/62)(P<0.01);在发生浆膜浸润的胃癌患者中强阳性率为77.6%(66/85),高于未发生浆膜浸润胃癌患者(52.9%,36/68)(P<0.05)。同时还发现,Tiam1在胃癌细胞浆和细胞核中均有表达,但在发生淋巴结转移和浆膜浸润的胃癌组织中,细胞核染色强度明显增强。③检索Kaplan-Meier plotter数据库发现:Tiam1高表达的胃癌患者总生存期明显短于Tiam1低表达的胃癌患者(P<0.05);在有淋巴转移的胃癌患者和发生远端转移的胃癌患者中,Tiam1高表达患者的总生存期比低表达患者显著缩短(P<0.05);在临床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的患者中,Tiam1高表达的患者总生存期比低表达患者显著缩短(P<0.05)。(3)Tiam1高表达促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭:MTT实验、平板克隆形成实验发现Tiam1表达下调显著抑制胃癌细胞的增殖能力(P均<0.05),Tiam1高表达显著提升胃癌细胞的增殖能力;划痕实验、迁移实验、浸润实验发现Tiam1表达下调时胃癌细胞的迁移、浸润能力下降,Tiam1高表达时胃癌细胞的迁移、浸润能力增强(P均<0.01)。(4)Tiam1通过EMT进程影响胃癌的演进:Western blot检测结果发现,Tiam1表达下调时上皮标志物E-cadherin和ZO-1的表达上调,而间质标志物Snail、ZEB-1、ZEB-2的表达下调,Tiam1高表达时,结果与之相反(P<0.01);免疫荧光实验显示,Tiam1表达下调时E-cadherin的荧光强度明显增强,而Vimentin的荧光强度明显减弱,Tiam1高表达时,结果与之相反。(5)Tiam1高表达促进胃癌的血管生成:Metascape数据库分析发现Tiam1与VEGF信号通路密切相关。Tiam1表达下调时,HUVEC细胞管型结构的形成能力明显降低,而Tiam1高表达时,HUVEC细胞管型结构形成能力明显增强(P<0.01);HLEC细胞微管形成实验结果与之一致(P<0.01)。Western blot结果显示Tiam1表达下调时,血管生成相关分子标志物VEGF、MMP-2、MMP-9的表达明显下调,而Tiam1高表达时VEGF、MMP-2、MMP-9的表达明显上调(P<0.01)。(6)Tiam1通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控胃癌的演进:String数据库分析发现Tiam1与PI3K信号通路中的PIK3CA具有一定的相关性。Western blot结果显示,Tiam1表达下调时PI3K/AKT/mTOR信号通路中相关分子标志物p-AKT、p-S6的表达下调(P<0.01),而AKT、S6的表达未发生明显变化;Tiam1高表达时,p-AKT、p-S6的表达上调(P<0.01),而AKT、S6的表达未发生明显变化。进一步的反向验证结果发现,应用PI3K/AKT/mTOR信号通路特异性抑制剂LY294002和Rapamycin分别处理MKN-45/ex-Tiam1细胞后,Western blot结果显示两个抑制剂处理组p-mTOR、p-AKT、p-S6的表达与MKN-45/ex-Tiam1细胞相比均显著下降(P<0.01),而mTOR、AKT、S6的表达未发生明显变化。划痕实验、迁移实验、浸润实验、HUVEC微管形成实验及HLEC微管形成实验结果显示,两个抑制剂处理组细胞的增殖能力、迁移能力、浸润能力和血管生成能力与MKN-45/ex-Tiam1细胞相比均明显下降(P<0.01)。细胞免疫荧光染色结果显示,LY294002和Rapamycin处理组细胞相对于MKN-45/ex-Tiam1细胞E-cadherin荧光信号明显增强,而Vimentin荧光信号则明显减弱。Western blot实验显示,LY294002和Rapamycin处理组相对于MKN-45/ex-Tiam1细胞中E-cadherin的表达上调,Snai1、Slug的表达下调(P<0.01)。结论:(1)Tiam1在胃癌中高表达,且与淋巴结转移、浆膜浸润等临床病理学参数密切相关,可预示患者的不良预后;(2)Tiam1高表达可促进胃癌细胞的增殖、迁移、浸润以及血管生成;(3)Tiam1可通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进胃癌细胞的EMT及血管生成等演进过程。