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粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe),是一类不能出芽生殖而只能以分裂和产孢子的方式繁殖的单细胞真核生物,近年来被广泛用作真核表达系统。它具有很多与高等真核生物类似的性质,使其在分子生物学研究中成为一种提供信息的、准确的真核模型,已成功应用在细胞重组、翻译、RNA拼接、染色体结构、有丝分裂、减数分裂、细胞周期等方面的研究,是研究细胞周期调控、染色体结构、性别分化中的信号转导等最好的实验模型之一,日益成为研究真核细胞生物学和分子生物学极具吸引力的实验系统。然而粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2自身的启动子Pnmtl受培养基中VB1浓度的严格调控,当培养基中含>0.5μM VB1时,Pnmtl被强烈抑制,不能启动目的基因正常表达。欲使Pnmtl正常发挥启动作用,得到人们所需要的外源目的基因的表达产物,培养酵母菌体时就必须使用不含有VB1的纯物质培养基,而此类培养基价格十分昂贵,不益应用于发酵工业上的大规模生产。CaMV 35S为植物表达载体中的强启动子。基因工程中,常使用GUS作为报告基因,研究35S启动子在转基因植物中的表达分布情况。本研究选用35S启动子,并将其与α因子信号肽一并连入pESP-2表达载体的多克隆位点处,构建了含有不受VB1浓度控制启动子的粟酒裂殖酵母分泌型表达载体。先将不受VB1浓度影响的35S启动子插入到pESP-2质粒的多克隆位点处,以GUS为报告基因,通过对35S在粟酒裂殖酵母重组质粒中表达活性的测定,证明35S能够成功替换pESP-2自身的启动子。本研究同时要构建分泌型表达载体,即需将35S启动子下游插入一段信号肽序列。为了验证连入的信号肽序列能否被粟酒裂殖酵母所正确识别,并使目的基因成功地分泌表达,将信号肽下游和终止子上游插入纤维素酶EGI基因。由于酶切位点的原因,无法将35S启动子、信号肽序列、EGI基因、NOS终止子依次连到粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2质粒上,所以需先构建依次含有这几段基因序列的中间载体pCAMBIA1301-35S.a-factor.EGI.NOS,随后以中间载体所提质粒DNA为模板,将35S+a-factor+EGI+NOS基因作为一个整体克隆下来,连接到pESP-2质粒上,并进行粟酒裂殖酵母转化。通过刚果红染色筛选出阳性转化子后,将其挑于含有VB1的EMM液体培养基中培养,通过对培养物上清进行DNS纤维素酶活力测定,证明含有不受培养基中VB1浓度控制的强启动子的粟酒裂殖酵母分泌型表达载体构建成功。