游离小孢子培养是将花粉母细胞减数分裂后的四分体细胞进行单细胞离体培养的技术。苜蓿为异花授粉植物，具有自交不亲和性，群体中个体的基因总是处于杂合状态，利用小孢子培养可以得到双单倍体(DH)植株，获得纯系。本试验研究了苜蓿小孢子发育时期与花器形态的相关性;低温、蔗糖饥饿、甘露醇等预处理条件对苜蓿小孢子存活率的影响;高温低温处理、培养基种类及成分、培养方法等因素对苜蓿小孢子产胚率的影响;利用流式细胞仪技术对10份新疆野生苜蓿进行了倍性水平鉴定。研究结果如下:　　(1)紫花苜蓿和黄花苜蓿小孢子发育分为四个时期，分别为四分体时期、单核早中期、单核靠边期、双核期，且各时期有明显的细胞学特征;花蕾纵径和花瓣长在小孢子发育四个时期之间均表现极显著差异，其它花器形态指标只是部分时期之间差异显著，因此花蕾纵径和花瓣长适宜作为小孢子发育时期的判断依据;紫花苜蓿和黄花苜蓿小孢子处于单核靠边期时的花瓣微露出花萼，紫花苜蓿纵径长和花瓣长分别在5.40-6.10mm和3.98-5.55mm之间，而黄花苜蓿的纵径长和花瓣长的范围分别为3.61-4.32mm和2.68-3.61mm。　　(2)紫花苜蓿花序预处理试验，采用B5液体培养基，4℃低温处理第1，2，3天小孢子存活率显著高于25℃的对照处理，处理1d存活率最高，为51.23％，3d后明显下降;培养基蔗糖饥饿处理后1d小孢子存活率为55.16％，显著高于对照;培养基不同浓度甘露醇处理对小孢子存活率的提高作用不明显。紫花苜蓿花药预处理试验，采用B5固体培养基，4℃低温处理、培养基蔗糖饥饿处理和不同浓度甘露醇处理对小孢子存活率的提高作用不明显。　　(3)紫花苜蓿游离小孢子的培养，将花序置于无蔗糖的B5液体培养基中4℃低温处理1d，选择单核靠边期的花蕾进行小孢子分离提纯，置于6-BA浓度为0.8mg/L，NLN培养基中进行液体浅层静置培养，培养密度为1.5×105-2.0×105个/ml，33℃暗培养一天后，进行25℃常温暗培养。培养16-18d出现胚状体，产胚率为17.88个/皿。　　(4)以新疆大叶紫花苜蓿和三得利紫花苜蓿为对照，利用流式细胞仪鉴定出来自新疆的10份野生黄花苜蓿种质材料均为四倍体。