论文部分内容阅读
背景结直肠癌是世界范围内发病率和死亡率均很高的恶性肿瘤,发生复发和转移是结直肠癌患者预后不良的主要因素。因此,研究结直肠癌复发和转移的分子机制,寻找新的肿瘤标志物,对于指导临床治疗具有极大的意义。转录因子通过调节多种癌基因和抑癌基因的表达进而发挥作用。FOX转录因子家族是一类具有共同的DNA结合结构域的分子。已有众多的研究表明FOX家族蛋白在多种生理和病理过程中发挥重要的调节作用,尤其是在肿瘤研究中,FOX家族蛋白的表达变化与众多肿瘤的发生及进展密切相关。FOXC1是FOX家族的重要成员之一,最早发现其在胚胎发育的不同过程中均发挥重要的调节作用。近年来,越来越多的研究发现FOXC1在多种肿瘤中表达增高。FOXC1通过多种机制促进肿瘤的转移。然而,FOXC1在结直肠癌转移中的作用及其相关分子机制仍然不甚明了。因此,有必要研究FOXC1在结直肠癌中的表达以及在结直肠癌转移中的作用,探讨FOXC1促进结直肠癌转移的分子机制。目的检测FOXC1在结直肠癌中的表达模式,分析其与患者预后的关系,研究FOXC1对结直肠癌细胞转移的影响,进一步寻找FOXC1的下游靶基因,探讨FOXC1促进结直肠癌转移的分子机制。方法采用PCR和免疫组化的方法检测FOXC1在人结直肠癌组织标本及癌旁非肿瘤组织中的表达情况,统计分析其与患者临床病理参数以及预后的关系。Western blot检测FOXC1在多种结直肠癌细胞系中的表达,选取差异表达显著的SW480和SW620这一对高低转移潜能细胞系进行后续实验。在低转移潜能细胞系SW480中上调FOXC1的表达,在高转移潜能细胞系SW620中下调FOXC1的表达,建立稳定感染细胞系,体外实验采用Transwell实验比较细胞迁移和侵袭能力的变化,体内实验采用裸鼠尾静脉转移模型,比较细胞发生肺转移的能力。在SW480-FOXC1和SW480-control细胞中采用人转移相关分子PCR芯片筛选得到受FOXC1表达影响显著的分子ITGA7和FGFR4。采用序列截短、位点特异突变以及染色质免疫共沉淀实验证实ITGA7和FGFR4启动子区域FOXC1的结合位点。在上调FOXC1表达的细胞系中下调ITGA7和FGFR4的表达,在下调FOXC1表达的细胞系中上调ITGA7和FGFR4的表达,体外实验采用Transwell实验,体内实验采用裸鼠尾静脉转移模型,比较细胞转移能力的变化。免疫组化进一步分析FOXC1与ITGA7及FGFR4表达的相关性,以及与患者临床病理参数及预后的关系。结果FOXC1 mRNA在人结直肠癌组织中的表达显著高于相邻癌旁正常组织以及人正常结肠粘膜上皮组织。FOXC1 mRNA在人结直肠癌相邻癌旁正常组织中的表达高于人正常结肠粘膜上皮组织。在69例复发的患者组织标本中FOXC1 mRNA的表达显著高于51例未复发的患者。FOXC1 mRNA在发生转移的结直肠癌患者原发灶中的表达显著高于未发生转移的结直肠癌患者原发灶中的表达水平。FOXC1 mRNA在转移灶中的表达显著高于原发灶。IHC实验发现FOXC1的表达主要定位于细胞核,并且FOXC1在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁非肿瘤组织。FOXC1的高表达与结直肠癌患者的肿瘤分化程度,肿瘤浸润,淋巴结转移,远处转移以及AJCC分期显著相关。生存分析表明,FOXC1阳性表达的患者与FOXC1阴性表达的患者相比,生存期更短,复发率更高。进一步多因素分析表明,FOXC1的表达是结直肠癌患者复发和预后不良的独立预测因素。在转移能力较强的细胞系中FOXC1的表达显著高于转移能力较低的细胞系。Transwell实验表明,在低转移潜能细胞系SW480中上调FOXC1的表达显著促进细胞的体外迁移及侵袭能力,在高转移潜能细胞系SW620中下调FOXC1的表达显著抑制细胞的体外迁移及侵袭能力。体内裸鼠尾静脉转移实验发现在低转移潜能细胞系SW480中上调FOXC1的表达显著增强裸鼠的肺转移信号强度,在高转移潜能细胞系SW620中下调FOXC1的表达显著抑制裸鼠的肺转移信号强度。进一步统计有无肺转移及肺转移结节数以及裸鼠的生存时间,得到了同样的结果。在SW480细胞系中上调FOXC1的表达后,ITGA7与FGFR4的表达也显著上调,在SW620细胞系中下调FOXC1的表达后,ITGA7与FGFR4的表达也显著下调。荧光素酶报告基因实验确认了FOXC1作用于ITGA7与FGFR4基因启动子区域的结合位点。ChIP实验进行了进一步验证,得到了同样的结果。Transwell实验表明,在SW480-FOXC1细胞系中下调ITGA7和FGFR4的表达显著抑制细胞的体外迁移及侵袭能力,在SW620-shFOXC1细胞系中上调ITGA7和FGFR4的表达显著促进细胞的体外迁移及侵袭能力。体内模型发现,在SW480-FOXC1细胞系中下调ITGA7和FGFR4的表达显著抑制裸鼠的肺转移信号强度。在SW620-shFOXC1细胞系中上调ITGA7和FGFR4的表达显著增强裸鼠的肺转移信号强度。进一步统计肺转移发生率,肺转移结节数,裸鼠生存时间,得到了同样的结果。在363例结直肠癌患者组织芯片中ITGA7和FGFR4的表达与FOXC1的表达呈正相关。高表达的ITGA7及FGFR4与CRC患者的肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移和AJCC分期显著相关。ITGA7及FGFR4阳性的患者与阴性的患者相比,总体生存期更短,复发率更高。FOXC1(+)ITGA7(+)双阳性表达的患者及FOXC1(+)FGFR4(+)双阳性表达的患者生存期最短,复发率最高。结论FOXC1在结直肠癌组织中的表达显著升高,其高表达与患者的临床病理参数及不良预后显著相关,并且是复发和预后的独立预测因素。体内外实验表明,下调FOXC1的表达抑制细胞的转移能力,上调FOXC1的表达增强细胞的转移能力。上调FOXC1促进ITGA7和FGFR4的表达,下调FOXC1抑制ITGA7和FGFR4的表达,ITGA7和FGFR4是FOXC1的直接靶基因。体内外实验表明,下调ITGA7和FGFR4的表达抑制细胞的转移能力,上调ITGA7和FGFR4的表达增强细胞的转移能力。ITGA7及FGFR4的高表达与患者的临床病理参数及不良预后显著相关,FOXC1与ITGA7或FGFR4共表达的患者生存期最短,复发率最高。由此证实,FOXC1可作为结直肠癌患者预后预测的生物标志物,作用于这一信号通路有望为结直肠癌患者的治疗提供新的靶点。