研究目的：　　Orexin-A 是近年来发现的一种含 33 个氨基酸的下丘脑多肽，主要通过其受体OX1R发挥作用。中枢Orexin环路的功能活动较复杂，参与多种生物过程的调控，包括觉醒、摄食、运动以及学习记忆等。Orexin-A分布较局限，主要分布于中枢下丘脑的外侧区（lateral hypothalamic area，LHA）和穹窿周区，但Orexin的受体分布较为广泛，其遍布于除了小脑以外的整个大脑，且下丘脑这些Orexin神经元与其它核团间形成广泛的纤维联系。虽然有较多文献显示Orexin参与摄食、睡眠/觉醒、焦虑等功能调控，但少有文献报道中枢Orexin信号通路对胃肠动力的影响。LHA内传出纤维广泛投射到整个皮层包括海马、杏仁核、基底节、丘脑、中脑和脑桥、脑干和脊髓，以及下丘脑的其他核团。LHA调控摄食的重要脑区，参与能量平衡、认知、骨骼肌运动、自主神经以及内分泌功能的调控，特别是与摄食调控有关。LHA损毁可导致摄食行为的完全抑制，而电刺激该区域则能促进摄食，这表明LHA是促摄食中枢。此外，在LHA有多种促食欲神经肽神经元的表达。Orexin-A可能参与和LHA相关的生理功能的调控。隔核属于边缘系统中的核团，参与学习记忆、情绪反应以及生殖行为的调控，也参与内脏活动包括心血管和胃肠道的调控。隔核是联系高位认知中枢和低位执行系统的枢纽。隔核神经元可接受来自于边缘系统如海马、嗅球、杏仁核、扣带回等各部位的神经纤维，同时发出神经纤维传至下丘脑和脑干，在情绪相关行为、内脏功能活动以及激素释放等方面发挥着重要作用。　　因此，本文将开展以下工作：　　①观察Orexin-A及其受体OX1R在外侧隔核和LHA的表达；阐明LHA至外侧隔核Orexin-A神经通路的构成；　　②探讨外侧隔核Orexin-A和电刺激LHA对外侧隔核内胃牵张（gastric distention，GD）敏感神经元放电活动的影响，阐明LHA至外侧隔核Orexin-A功能通路的构成；　　③探讨外侧隔核Orexin-A和电刺激LHA对胃运动的影响，为完善胃运动的中枢调控机制提供参考。　　研究方法：　　1. 采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）和荧光免疫组化技术，观察Orexin-A与其受体OX1R在外侧隔核的表达；采用荧光金（Fluorogold，FG）逆行追踪结合荧光免疫组化技术，观察LHA至外侧隔核Orexin-A神经通路的构成。　　2. 采用微量注射、电刺激、细胞外放电记录技术，观察外侧隔核注射Orexin-A和OX1R拮抗剂SB-334867，以及电刺激LHA对外侧隔核GD敏感神经元放电活动的影响。　　3. 采用电刺激、电损毁、在体胃运动记录技术，观察外侧隔核注射Orexin-A和OX1R拮抗剂 SB-334867，以及电刺激 LHA、电损毁外侧隔核对大鼠胃运动的影响；采用real-time PCR和WB方法，观察电刺激LHA对外侧隔核Orexin-A及其受体OX1R mRNA和蛋白表达水平的影响。　　结果：　　1. PCR 实验结果发现大鼠外侧隔核有 Orexin-A 及其受体 OX1R mRNA 的表达；Western blot 实验结果显示在大鼠外侧隔核有prepro-Orexin及其受体OX1R蛋白的表达；荧光免疫组织化学实验结果表明大鼠外侧隔核有Orexin-A及OX1R免疫阳性神经元表达。　　2. LHA 发出纤维投射至外侧隔核，并呈同侧投射优势；LHA 有 Orexin-A 免疫阳性神经元向外侧隔核的纤维投射。　　3. 在外侧隔核共记录到208个神经元自发性放电，其中162个（162/208，77.88%）对胃牵张刺激有反应，鉴定为GD神经元。在162个GD神经元中，93个（93/162， 57.41%）在胃牵张刺激后放电频率由 5.16 ± 1.05Hz 增加到 7.68 ± 1.64Hz （P<0.01），平均增加48.84 ±10.69%，潜伏期为11.98±2.88s，持续时间为66.87 ±9.59s，确定为GD-E神经元；69个（69/162，42.59%）GD神经元放电频率下降，确定为GD-I神经元，放电频率从5.23±1.12Hz降低到3.04±0.96Hz（P<0.01），下降幅度为 38.96±11.22%，潜伏期为 12.55±3.47s，大约持续 62.98±11.47s。说明外侧隔核可接受来自于胃肠道的信号传入。　　4. 外侧隔核微量注射Orexin-A后，在93个GD-E神经元中，其中61个（61/93， 65.59%）GD-E 神经元兴奋，其放电频率从 5.23±1.12 Hz 升高到 8.17±2.14 Hz （P<0.01），平均增加 56.21±12.33%，潜伏期约为 30.87±9.54s，持续时间为144.54±33.48s；22个（22/93，23.66%）GD-E神经元被抑制，10个（10/93,10.75%）神经元无明显变化。外侧隔核内预先注射 Orexin-A 受体拮抗剂 SB-334867， Orexin-A对GD-E神经元的兴奋作用完全消失。外侧隔核注射生理盐水或SB-334867 对 GD-E 神经元的放电活动无明显影响（P>0.05）。外侧隔核微量注射Orexin-A，69 个 GD-I 神经元中有 38 个（38/69，55.07%）放电频率显著增加（5.04±1.21 Hz vs. 7.96±2.09Hz，P<0.01），平均增加57.94±15.07%，潜伏期约28.46±8.22s，持续时间约136.77±29.67s；20个（20/69，28.99%）GD-E神经元抑制，11个（11/69，15.94%）无明显变化。外侧隔核内预先注射Orexin-A受体拮抗剂SB-334867，Orexin-A对GD-I神经元的兴奋作用可完全被阻断。外侧隔核注射生理盐水或 SB-334867 对 GD-I 神经元的放电活动无明显影响（P>0.05）。说明外侧隔核 Orexin-A 参与胃牵张传入信息的调控，该过程可能通过OX1R信号通路实现。　　5. 在外侧隔核记录到的61个Orexin-A兴奋的GD-E神经元中，电刺激LHA后，有48个（48/61，78.69%）兴奋，放电频率从5.05±0.88Hz升高到9.17±2.09 Hz（P<0.01），平均增加81.58±17.96%，持续时间为155.12±36.59s；有8个（8/61，13.11%）GD-E神经元抑制，5个（5/61，8.20%）无明显变化。外侧隔核内预先注射Orexin-A受体拮抗剂SB-334867，电刺激 LHA引起的外侧隔核内Orexin-A兴奋的GD-E神经元的兴奋效应明显降低（P<0.05）；外侧隔核内单独注射生理盐水或SB-334867对神经元放电频率无明显影响（P>0.05）。在外侧隔核记录到的38个Orexin-A兴奋的GD-I神经元中，电刺激LHA后，有24个（24/38，63.16%）兴奋，放电频率从5.11±1.14Hz增加到10.42±1.87Hz（P<0.01），平均增加103.91±20.88%，持续时间为 149.65±30.74s；4个（4/38，10.52%） GD-I神经元抑制，而10个（10/38，26.32%）无显著改变。外侧隔核内预先注射Orexin-A受体拮抗剂SB-334867，电刺激LHA引起的外侧隔核内Orexin-A兴奋的GD-I神经元兴奋效应明显下降（P<0.05）。外侧隔核内单独注射生理盐水或SB-334867，该神经元放电频率无明显变化（P>0.05）。　　6. 外侧隔核微量注射不同剂量Orexin-A（0.1g/L、1.0g/L或10g/L Orexin-A）大约5min后，与NS组比较，大鼠胃收缩幅度和频率显著增加，并呈现明显的剂量依赖关系（P<0.05-0.01）；低、中、高剂量的Orexin-A可分别使胃收缩幅度和频率变化率的增加持续时间为：5-10min、10-15min和10-20min。单独注射OX1R拮抗剂SB-334867 或NS 对胃收缩幅度和为收缩频率均无显著影响（P>0.05，表10，图15）；注射Orexin-A+SB-334867混合液后，Orexin-A对大鼠胃运动的促进作用可被完全阻断（P<0.05）。　　7. 与假刺激组（SS）比较，电刺激LHA后大约3min，大鼠胃运动幅度和频率均显著增加（P<0.05-0.01），电刺激后±13 min胃运动收缩幅度和频率达到高峰。与NS+ES 组比较，SB-334867+ES 组大鼠胃收缩幅度和为收缩频率均显著下降（P<0.05-0.01），但与SB-334867+SS组比较，胃收缩幅度和为收缩频率仍有显著增加（P<0.05-0.01），即外侧隔核注射OX1R拮抗剂SB-334867可部分阻断电刺激LHA引起的大鼠胃运动兴奋作用。外侧隔核单独注射SB-334867或NS，大鼠胃收缩幅度和收缩频率均无明显改变（P>0.05）。　　8. 与假损毁（SL）组比较，电损毁外侧隔核（EL），大鼠胃收缩张力显著下降（P<0.05），提示，外侧隔核可能参与大鼠胃运动调控。电刺激LHA可显著增加大鼠胃运动幅度和胃运动频率（SL+ES vs. SL+SS，P<0.05-0.01）。但与外侧隔核假损毁后再电刺激LHA组比较，外侧隔核电损毁后电刺激LHA大鼠胃运动幅度和胃运动频率均明显降低（EL+ES vs. SL+ES比较，P<0.05）。与EL+SS组比较，EL+ES组大鼠的胃运动幅度和胃运动频率均明显增加（P<0.05-0.01），据此推测，LHA可能除了通过外侧隔核神经通路参与胃运动的调控，还可能存在其它神经通路参与胃运动调控。　　9. Real-time PCR、Western blot结果显示，电刺激LHA，外侧隔核Orexin-A、OX1R mRNA表达水平以及prepro-Orexin、OX1R蛋白表达水平均无显著改变（P>0.05）。　　结论：　　1. 外侧隔核有Orexin-A及其受体OX1R的表达，外侧隔核可接受来自胃的传入信息并参与胃运动调控；提示，外侧隔核可能是Orexin作用位点之一；　　2. 外侧隔核 Orexin-A 参与胃牵张传入信息和胃运动功能调控，该调控可能通过OX1R信号通路实现；　　3. LHA-隔核存在 Orexin 神经和功能通路，该通路参与胃传入信息和胃动力调控。　　意义：　　1. 寻找胃运动功能调控新途径，阐明LHA至隔核的胃运动调控的神经及功能通路，为临床治疗诸如肥胖症等代谢性疾病提供新的思路或方法。　　2. 为进一步探讨LHA除外侧隔核神经通路外，是否存在其它参与胃运动调控的神经通路提供新的思路。