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NOD-样受体(NOD-like receptors, NLR)是胞质型模式识别受体(PRR),它同TLR、RLR等一样,可以通过识别病原相关分子模式(PAMP)而迅速启动先天性免疫反应,并能通过NF-κB和MAPK等信号传导途径启动适应性免疫反应,在机体的免疫防御过程中发挥着重要作用。NOD1是NLR家族中最具代表性的一个成员,在先天性免疫中参与炎症反应和细胞凋亡过程,也与一些炎症性疾病的发生有关。研究报道,NLR家族在人有23个成员,在鼠至少有34个成员,但在禽类的研究报道很少,未见具体有多少成员的明确报道。目前,对于禽类的NOD1的研究尚处于起步阶段,而鸡是一种重要的模式动物,同时也是重要的经济动物,因此,本研究以鸡为研究对象,克隆鸡NOD1基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析；探查鸡NOD1信号通路中NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11基因在组织中的表达情况；通过NOD1的特异性配体iE-DAP刺激HD11细胞实验和RNA干扰实验,探讨鸡NOD1基因对下游信号分子及细胞因子的调节作用；通过体内和体外沙门氏菌感染实验,探讨鸡NOD1信号通路在抗沙门氏菌感染过程中的作用。1.鸡NOD1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析本研究通过反转录PCR (Reverse transcription PCR)方法,3’和5’末端延伸技术(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)扩增并获得鸡NOD1基因的全长cDNA序列。该基因全长cDNA为4502bp,包含124bp的5’UTR,2856bp的开放阅读框(ORF)和1497bp的3’UTR,后接22bp的polyA尾巴。ORF finder分析表明,鸡NOD1基因的开放阅读框位于125-2980区域,编码一条含有951个氨基酸的蛋白质。采用ProtParam在线软件进行理化性质分析,该蛋白质分子量为108676.2Mr,理论等电点(PI)为6.58,总原子数为15308,分子式为：C4885H7669N1285O1421S48,不稳定系数为36.77,总平均亲水性为-0.160。经预测,鸡NOD1蛋白无信号肽和跨膜区。通过NCBI在线BLSTn,将序列直接与鸡基因组进行比对,该序列位于鸡的2号染色体41824884-41845174位置,基因全长20290bp。预测蛋白结构域的结果表明,鸡NOD1蛋白由三个结构域组成,分别为N端的CARD、中间的NACHT以及C端的LRR结构域,经比较,与鸭、火鸡、人、小鼠、鱼的NOD1蛋白结构域一致。利用ClustalW软件进行多序列比对,并用MEGA软件基于Poisson Correction模型构建了进化树,表明鸡NOD1蛋白与火鸡亲缘关系最近,与哺乳类动物的亲缘关系近于与鱼类动物的。2. Real-time PCR检测鸡NOD1信号通路相关分子方法的建立及应用根据GenBank上公布的鸡NOD样受体NOD1、信号传导分子RIPK2、TRAF6、CARD9、 NF-κB (p65、MAPK11和细胞因子IL-1β、IL-8的mRNA序列,以β-actin为内参基因,设计并合成8个目的基因及1个内参基因的PCR扩增引物,建立检测鸡NOD1、RIPK2、 TRAF6、CARD9、NF-κB (p65)、MAPK11和细胞因子IL-1β、IL-8 mRNA表达水平的相对荧光定量PCR方法。试验结果显示,9个基因的荧光定量PCR方法溶解曲线均呈单峰,溶解温度在81.5℃～89.0℃之间,RT-PCR扩增效率为96.3%～102.3%,相关系数为0.966-0.996,斜率为-3.269～-3.413；Ct值的变异系数在1.85%～3.84%之间。表明,所建立的检测8个目标基因和1个内参基因mRNA表达水平的荧光定量PCR方法特异性强、重复性高,完全满足实验要求,为后续试验研究提供技术支持。3.鸡不同组织中NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11的表达谱分析NOD1是NLR受体中的一个重要成员,RIPK2是其接头分子,RIPK2的活化可以引起下游NF-κB和MAPK信号转导途径的激活,因此,研究鸡的不同组织器官中NOD1及其相应接头蛋白RIPK2及信号传递分子NF-κB和MAPK11的表达水平,有助于理解和分析机体对病原的先天性免疫应答过程。为确定NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11 mRNA在鸡体内组织中的表达情况,本研究对1日龄雏鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、小肠(十二指肠)、脑、睾丸、卵巢、直肠和血液共13种组织中该四个基因mRNA表达进行检测,结果发现,NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11在检测的13种组织中均有表达,但同一基因在不同组织中的表达量差异较大。其中,NOD1和NF-κB在血液中表达最高,RIPK2、MAPK11在脑组织中表达量最高。说明,NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11在鸡体的各组织中广泛表达。4.鸡NOD1基因对下游信号分子的调节作用研究为了探讨鸡NOD1基因对下游信号通路相关分子的调节作用,本研究通过RNAi抑制和外源性iE-DAP诱导NOD1的表达后,检测了RIPK2、NF-κB、TRAF6、CARD9、MAPK11、 IL-1β和IL-8等基因的表达变化,以探讨NOD1在HD11细胞中对这些基因的调节作用。本研究构建了三个表达质粒和一个阴性对照质粒,即PLL3.7-NOD1-shRNA1、 PLL3.7-NOD1-shRNA2、PLL3.7-NOD1-shRNA3和PLL3.7-NOD1-control shRNA。三个表达质粒在HD11细胞中的抑制效率结果表明,与PLL3.7-NOD1-control shRNA相比,PLL3.7-NOD1-shRNA1、PLL3.7-NOD1-shRNA2和PLL3.7-NOD1-shRNA3印制效率在48h时分别为34.1%、19.3%和81.4%,在72h时分别为37.9%、58.1%和69.1%。检测了转染PLL3.7-NOD1-shRNA3表达载体和iE-DAP处理的HD11细胞中的PIPK2、NF-κB(p65)、TRAF6、CARD9、MAPK11、IL-1β和IL-8的表达水平,结果发现,在PLL3.7-NOD1-shRNA3抑制和iE-DAP激活HD11细胞中NOD1的表达水平后,除IL-1p外,信号传导分子RIPK2、 NF-κB(p65)、TRAF6、CARD9、MAPK11细胞因子IL-8的表达水平也出现了相应的下调和上调。这些结果提示,鸡NOD1基因对其信号通路下游信号转导分子RIPK2、 NF-KB(p65)、TRAF6、CARD9、MAPK11及细胞因子IL-8的表达具有正向调节作用。5.鸡NOD1信号通路对沙门氏菌的识别作用已有研究表明沙门氏菌可以激活NOD1信号通路,NOD1蛋白通过与下游的受体作用蛋白-2(RIPK2)分子相互作用,激活NF-κB、MAPK信号通路。然而,在禽类,沙门氏菌感染是否可以激活NOD1信号通路尚不清楚,因此,为了研究鸡NOD1信号通路相关基因在沙门氏菌感染过程中的作用,本研究通过在体实验,选择10日龄AA肉鸡,经皮下每只注射0.2m1浓度为1×108cfu/mL的鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌菌液,同时设立对照组。检测沙门氏菌感染后的1d、3d、5d和7d脾脏和血液中NOD1、RIPK2、NF-κB、MAPK11、IL-1β和IL-8表达量变化。结果显示,鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌感染后,NOD1、RIPK2、 NF-κB、MAPK11、IL-1β和IL-8的表达量在感染后的1-7d呈波动变化,表达量高峰是在感染后的3d、5d或7d。在HD11细胞中,用鸡白痢沙门氏菌感染细胞,检测NOD1信号通路相关基因表达,结果表明,NOD1基因的表达量在鸡白痢沙门氏菌感染的3.5h和6h显著降低,1h、24h显著增加；RIPK2在鸡白痢沙门氏菌感染后6h,NF-κB在鸡白痢沙门氏菌感染后1h表达量显著下降,3.5h、6h和24h显著增加；MAPK11的表达量在鸡白痢沙门氏菌感染后的1h、6h略有下降但差异不显著,24h时表达量显著增加。细胞因子IL-1p和IL-8的表达量在鸡白痢沙门氏菌感染后的1h、3.5h、6h和24h的表达量均显著增加。用iE-DAP处理HD11细胞,再进行鸡白痢沙门氏菌感染,检测鸡白痢沙门氏菌对细胞的侵袭率及在细胞内的增殖情况。结果表明,iE-DAP处理组的鸡白痢沙门氏菌的侵袭率和未处理组的侵袭率没有显著差异,但在4h和6h时,iE-DAP处理组的胞内细菌数量显著低于未用iE-DAP处理组的细菌数。结果提示,鸡NOD1信号通路在鸡和HD11细胞对沙门氏菌的清除过程中具有重要作用。