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猪传染性胃肠炎(Porcine transmissible gastroenteritis,TGE)是猪的一种急性、高度接触性肠道传染病。该病由猪传染性胃肠炎病毒(TGE virus,TGEV)引起,以严重的呕吐、腹泻及2周内仔猪高死亡率为特征。TGE与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪Delta冠状病毒及猪轮状病毒等引起的临床症状相似,临床鉴别诊断困难。胶体金免疫层析试纸具备适合兽医临床快速诊断,特异性高、操作简单等特点。已知TGEV N蛋白是TGEV抗原和抗体检测方法研究的重要靶蛋白。因此,本研究以N蛋白为靶蛋白,制备单克隆抗体,研制快速检测TGEV抗原的胶体金免疫层析试纸,旨在为TGE的快速诊断与防治提供重要技术支撑。本研究以弗氏佐剂乳化的重组TGEV N蛋白免疫3只雌性BALB/c小鼠,共免疫3次,间隔2周。第3次免疫后10天,经ELISA检测3只小鼠的血清特异性抗体效价在1:10240~1:20480之间,选取抗体效价为1:20480的小鼠于融合前用N蛋白进行腹腔冲击免疫。冲击免疫后第3天取小鼠脾细胞与杂交瘤细胞进行细胞融合,通过ELISA筛选分泌TGEV N蛋白特异性抗体的阳性孔。阳性孔经过3次亚克隆后,最终获得了4株分泌TGEV N蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为2F5、1G11、1F12、1B10。Western blot鉴定显示,4株McAb均能够与TGEV N蛋白特异性结合。免疫过氧化物酶单层试验鉴定显示,4株单抗均能够与感染PK15细胞内的TGEV特异性结合。4株杂交瘤细胞分泌的抗体均为IgG1亚类和Kappa链(IgG1κ)。进而将4株杂交瘤细胞腹腔注射给10周龄的雌性BALB/c小鼠,制备了4株单抗的腹水,经ELISA检测腹水抗体效价分别为1:655360、1:655360,1:1310720、1:655360。同时,以弗氏佐剂乳化的N蛋白免疫2只健康新西兰大耳白兔制备了抗N蛋白多克隆抗体,经过3次免疫后,ELISA抗体效价>1:10~5,经Western blot鉴定,其能够与TGEV N蛋白和TGEV特异性结合。进而以小鼠单抗纯化试剂盒纯化后的2F5单克隆抗体作为检测线(3 mg/mL),以经饱和硫酸铵沉淀法和DEAE-纤维素层析法提取和纯化的兔抗TGEV N多克隆抗体(150μg/mL,pH 8.0)作为金标抗体,以羊抗兔IgG(1 mg/mL)作为质控线,组装试纸条。将该试纸条能够特异地与TGEV N蛋白反应,能够检测到TGEV N蛋白的最低浓度为3.125μg/mL。试纸条与猪流行性腹泻病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸病毒等无交叉反应。最后用组装的试纸条和RT-PCR检测15份临床腹泻仔猪的小肠及内容物,试纸条与RT-PCR的阳性检出率分别为20.0%(3/15)和26.7%(4/15),两者的符合率为93.33%。该结果表明,初步制备的基于TGEV N蛋白单克隆抗体的胶体金免疫层析抗原检测试纸条能够快速、特异地检测临床样本中的TGEV,可用于TGE的现场诊断。