毛果杨PtrWRKY73转录因子在转基因拟南芥中的抗病及抗旱研究

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杨树是一种具有重要工业价值的经济林木,多用于造纸、橡胶生产和家具制造。杨树生长周期长,常常遭受不同的生物与非生物胁迫,包括各种各样的病原菌如真菌和细菌,以及干旱、盐碱等。近年,随着分子生物学的发展,采用基因工程的手段对杨树进行改良,从而获得抗病优良品种,已成为杨树分子育种的新策略。研究表明,植物WRKY转录因子广泛参与了抗病、抗旱反应,但关于杨树中WRKY转录因子的研究还比较少。因此,筛选杨树中参与抗病及抗旱过程的WRKY转录因子,阐明其生物学功能,不仅可揭示植物抗病和抗旱过程的转录调控机制,还可为培育抗病、抗旱的杨树新品种提供参考。本研究从毛果杨中分离克隆得到PtrWRKY73基因,该基因受茉莉酸甲酯(Methyl jasmonic acid)、水杨酸(Salicylic acid)、溃疡病(Dothiorella greariasacc Sacc.)、氯化钠(NaCl)、聚乙二醇6000(PEG-6000)的诱导。PtrWRKY73蛋白含有两个WRKY结构域,属于WRKY Ⅰ家族,同时,由于其N端存在D域和SP集群,暗示PtrWRKY73可能参与了蛋白的磷酸化。组织表达谱分析表明,PtrWRKY73主要在根、老叶、芽和茎表达,特别是在韧皮部的表达量尤为高。亚细胞定位试验显示PtrWRKY73蛋白在细胞核中积累,酵母单杂交试验证明PtrWRKY73蛋白能够激活报告基因的表达,具有转录激活活性,上述结果表明PtrWRKY73蛋白是一个转录激活因子。在拟南芥中超量表达PtrWRKY73,抗病分析显示,转基因植物对活体寄生型细菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000)的抗病性得到了显著的提高,但对腐生型真菌灰霉菌(Botrytis cinerea)敏感性增强。在分子水平上检测发现,转基因拟南芥中SA途径介导的抗病相关基因(PR1、PR2和PAD4)的表达量显著上调。以上结果表明,PtrWRKY73正向调控了SA介导的抗病途径,增强植物对活体寄生型病原菌的抗性,而对腐生型病原菌的敏感性增加。同时发现,过量表达PtrWRKY73的转基因拟南芥相对野生型具有更强的耐旱性。对四周龄的拟南芥进行干旱处理发现,野生型拟南芥叶片枯萎程度严重,而转基因植株叶片枯萎程度较轻,仅表现出轻微发红。进一步分别统计了野生型和转基因植株L47和L49的气孔宽长比,分别为0.295131、0.141165和0.182188,同时,统计了野生型和转基因植株L47和L49单位面积内气孔的数量,分别为175.774、158.3892和137.6774。这些数据表明转基因植株不仅气孔宽长比明显小于野生型,单位面积内气孔的数量也显著少于野生型。以上结果揭示PtrWRKY73通过使转基因拟南芥气孔开口减小、气孔数量减少,增强了转基因植株的抗旱性。在分子水平检测了PtrWRKY73过量表达植株中抗旱相关基因的表达情况,发现胁迫相关的标记基因RD29A、ABA合成途径的关键酶基因NCED3和脱水蛋白编码基因RAB18均显著上调。上述研究结果表明,PtrWRKY73通过正调控SA介导的抗病通路,提高了转基因植物对活体寄生型病原菌的抗性,但增强了其对腐生型病原菌的敏感性。另一方面,PtrWRKY73通过控制转基因植物叶片气孔的大小和数量,以及促进ABA下游基因的表达,提高了植物的抗旱能力。
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