禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起禽类的一种从轻度的呼吸道症状到全身严重性败血症等多种症状的传染病。由于致病力的不同,禽流感分为高致病性(High pathogenic avian influenza,HPAI)和低致病性(Low pathogenic avian influenza,LPAI),这些致病性导致禽类死亡症状不同。根据病毒表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同,禽流感可分为多种亚型,目前共有18种HA亚型和11种NA亚型。禽流感病毒不仅感染鸡、鹌鹑、鸭及野禽等禽类,而且还感染猪、马等哺乳动物以及人类。由于H9N2亚型禽流感病毒致病率低,禽类感染后症状表现不明显或者无症状,从而导致H9N2在禽类中大面积流行,给养殖业带来了很大的经济损失,因此对H9N2亚型禽流感病毒的防控至关重要。本研究通过对GenBank上获得国内各地区H9N2亚型禽流感病毒基因序列,分别绘制HA、NA基因进化树,了解H9N2亚型禽流感病毒疫情分布情况。将吉林地区18株H9N2亚型禽流感病毒分离株和2株参考毒株的HA和NA基因进行扩增和序列测定,并对HA、NA基因进行进化分析,掌握吉林地区H9N2亚型禽流感病毒分离株在国内的流行趋势,分析分离毒株亲缘关系和进化关系。针对国内H9N2亚型病毒分离株HA基因的五个分支中的5株典型毒株分别设计了特异性引物和探针,建立了不同的荧光PCR检测方法。然后对H9N2亚型流感病毒的HA和NA基因采用体外转录的方法获得HA-cRNA和NA-cRNA,以cRNA为模板制备了应用于H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因检测的标准品,为H9N2亚型禽流感病毒的检测提供了标准物质。1、从GenBank上获得国内各地区流行的H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA基因序列,其中1619株HA基因,1104株NA基因,按照时间、地区、宿主等信息进行筛选,分别绘制进化树。结果表明,国内流感毒株共分为北美谱系和欧亚谱系,HA基因共分为五个分支,NA基因分为四个分支。HA、NA基因的各个分支覆盖了我国绝大部分地区,各分支之间没有明显的地域分布差异。病毒株多来源于广东、山东和一些沿海地区,且宿主以鸡源为主。对吉林地区18株H9N2亚型流感病毒分离株和2株参考毒株分别进行HA和NA基因扩增和序列测定,同时对HA、NA基因进行进化分析,通过进化比较分析可以看出,所有分离株分布于HA基因第一至三个分支和NA基因第一、二分支,其中HA基因第五分支属于北美谱系,该谱系以TY66为代表毒株且毒株较少共11株,分离株多来自于野鸟和水禽。其他分支均属于欧亚谱系,其中第四分支只有6株,以HKG1为代表毒株,毒株多来自沿海地区,水禽居多。第三分支毒株共87株,发现时间较早,本试验分离株与代表毒株BJ94亲缘关系较近。第一、二分支共1515株,以Y280为代表毒株,大部分的分离株集中在这两个分支上。NA基因的第四分支是以TY66为代表毒株的北美谱系,该分支共有8个毒株,其它三个分支均为欧亚谱系;第三分支以HKG1为代表毒株,该分支毒株只有6株,毒株也以水禽居多;第二分支有213株,且分离时间较早;第一分支共有887株,近些年的分离株大多集中于该分支。2、为了区分各分支中分离株,建立了特异性荧光PCR的方法,本研究针对5个分支代表毒株的HA基因序列分别设计一对特异性引物和探针,以标准阳性质粒为模板,构建荧光PCR标准曲线,建立荧光PCR检测方法。实验结果显示,将稀释后的质粒,进行荧光PCR扩增,可以分别扩增到10~2 copies/μL和10~1 copies/μL,其它毒株均未被扩出,证明该方法具有很好的敏感性及特异性。稳定性实验表明,对重组质粒10~8 copies/μL~10~6 c opies/μL的浓度进行三次扩增,能呈现较好的梯度曲线,稳定性较好。3、为了提高对H9N2亚型流感病毒检测结果的准确性,本试验针对2株试验毒株的HA、NA基因进行全长的扩增,构建了含有T7启动子的重组质粒,测序成功后,通过体外转录可以快速获得大量的HA-cRNA和NA-cRNA片段。测得产物浓度分别为346 ng/μL、301 ng/μL,经连续倍比稀释后,以此为模板进行Real-time RT-PCR检测,绘制标准曲线图,测定值基本在一条直线上,扩增曲线良好,可用作核酸检测的标准物质。随后对标准物质进行均匀性、稳定性和不确定度分析,经计算结果显示,满足标准样品对均匀性的要求,检测组在稳定性监测期内是稳定的。由于H9N2亚型禽流感在世界范围内广泛流行,为了减少其暴发的可能性,我们应及时掌握该亚型在国内的流行趋势,加强监控和防范措施,保障健康养殖和食品安全。