癌症是当今世界最重要的公共健康问题之一。肿瘤发生过程中,其利用细胞外信号来实现自身的细胞增殖,迁移和凋亡逃逸,从而获得超越正常细胞的生长优势。上述细胞外信号转导的一部分是由细胞膜受体所产生的。目前的细胞膜受体研究主要包括两大类：G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors, GPC R)和生长因子受体即受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinases, RTK)。G蛋白偶联受体是体内最大的(>1000)细胞膜受体家族,它介导了体内大部分生理及病理过程。G蛋白偶联受体的功能主要受到三个家族的蛋白调节：异三聚体G蛋白、G蛋白偶联受体激酶(GRKs)和β-arrestins。β-arrestins不仅可以作为接头蛋白调节受体的脱敏还可以自己的方式再次转导相关信号。受体酪氨酸激酶家族(RTKs)是一个包括约60名成员的细胞膜表面受体家族。RTKs是临床治疗中重要的肿瘤治疗靶点,其中,胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like growth factor receptor type 1, IGF-1R)是最有吸引力的靶点之一。IGF-1R在细胞的恶性转化、增殖、转移、恶性表型维持中起重要作用。尽管强有力的临床前证据提示抑制IGF-1R可以使肿瘤广泛获益,但是干预IGF-1R的临床试验教训表明,初始依赖IGF-1R的肿瘤在抑制IGF-1R的治疗下迅速产生耐药现象。几乎所有成功应用于临床的酪氨酸激酶抑制剂的疗效预测依赖于受体的突变激活或过度表达,但IGF-1R不存在这两种情况。作为一种RTK,IGF-1R的酪氨酸磷酸化是调控IGF-1R信号转导的关键。然而在过去的十年中,研究者们发现了泛素化过程同样参与IGF-1R的功能调节,上述发现对IGF-1R的传统模式提出了挑战。研究表明β-arrestin1作为接头蛋白可以引导E3泛素连接酶Mdm2结合到IGF-1R,并导致IGF-1R信号的双重结果：泛素化及受体下调和IGF-1R/β -arrestinl介导的MAPK信号激活。β-arrestinl对IGF-1R的双重调节作用与其在GPCR中的作用非常相似：结束G-蛋白信号时,β-arrestins重新启动MAPK信号。Figitumumab(CP)是一种IGF-1R的人源化单抗,设计该抗体的初始目的是阻断配体受体结合,然而CP还可诱导明显的受体降解下调。进一步研究表明该靶向抗体可以作为一种“偏倚性的”IGF-1R激动剂招募p-arrestin1到IGF-1R并引起受体泛素化、内吞及降解和ERK1/2信号的激活。上述研究进一步证明了作为典型RTK的IGF-1R具备了某些GPCR的功能,因此IGF-1R/GPCR的串话新机制将为IGF-1R的靶向治疗带来新的思路和理论依据。本课题将深入探索IGF-1R/GPCR串话的分子机制。明确β-arrestins及GRKs在偏倚性配体CP刺激下的作用,发现调控IGF-1R信号通路的关键分子。本课题还将利用质粒定点突变及转染技术证实IGF-1R/GPCR串话的存在,这将为IGF-1R的靶向治疗走向临床提供新的希望。第一部分靶向IGF-1R治疗食管癌的作用及分子机制研究[研究目的]1.明确食管癌中IGF-1R的表达及其与患者预后的关系；2.探讨IGF-1R单抗CP在食管癌中的治疗作用；3.探索CP是IGF-1R的一种偏倚性配体及其对IGF-1R下游信号通路的影响。[研究方法]1.选取于山东省立医院胸外科手术的食管癌病理标本110例,应用免疫组织化学方法检测IGF-1R的表达情况,统计学分析受体表达与食管癌病人临床病理特点及预后的联系。2.采用细胞增殖、克隆形成、划痕实验及凋亡蛋白检测探索CP在食管癌细胞系中的治疗作用。3.免疫印迹技术检测相关信号通路激活及蛋白水平。4.免疫共沉淀技术检测相关蛋白结合情况。[研究结果]1.110例食管癌临床切除标本中,分别有25、21、48、16例标本IGF-1R表达评分为0、1、2、3。0和1为低表达,2和3为受体高表达。卡方检验提示IGF-1R表达和性别相关,与其他临床特点不相关。生存分析表明IGF-1R高表达患者预后不良,是食管癌的一个独立预后指标。2.CP可抑制食管癌细胞的生长以及增加肿瘤细胞对常用化疗药物的敏感性。此外,CP可抑制IGF-1诱导的细胞增殖、细胞迁移、克隆形成及抗凋亡作用。3.TE-1细胞的基础ERKl/2磷酸化水平较Eca-109更加明显,IGF-1刺激10分钟,两个细胞系均有明显的IGF-1R磷酸化及下游的Akt和ERK1/2的磷酸化。细胞系使用CP预处理一小时后,IGF-1刺激,结果提示CP预处理组细胞IGF-1R磷酸化受阻,Akt未见激活,而ERK1/2的磷酸化水平较弱且延迟。此外,完全培养基情况下,CP处理的细胞IGF-1R磷酸化水平降低。4.对比IGF-1和CP引起的受体下调显示CP引起的受体降解下调更明显。免疫碍共沉淀结果表明受体的泛素化是二者下调受体的机制。蛋白酶体途径抑制剂处理后,CP引起的IGF-1R下调明显受阻。二者刺激下细胞均可见IGF-1R与β-arrestinl的结合。过表达β-arrestinl增加CP诱导的受体降解,而沉默β-arrestinl则部分抑制CP诱导的受体下调。5.IGF-1和CP分别直接刺激食管癌细胞,同IGF-1相比,CP引起下游的ERK1/2磷酸化程度较弱,并且CP引起ERK1/2的活化时间延迟。下调p-arrestinl的表达可以降低CP诱导的ERK1/2的磷酸化。ERK1/2的抑制剂U0126可增加食管癌细胞对CP的敏感性。6.过表达GRK2或者沉默GRK6,CP诱导的ERK1/2的磷酸化早期稍微增强而晚期明显减弱、IGF-1R下调程度降低；沉默GRK2或者过表达GRK6,CP诱导的ERK1/2磷酸化早期减弱而晚期明显增强、且IGF-1R下调程度增加。[结论]1.IGF-IR的表达是食管癌完全切除患者的一个独立预后指标。IGF-1R的单抗CP在体外对食管癌具有一定的治疗作用。2.CP不仅可阻断IGF-1R的自体磷酸化及下游Akt和ERK1/2的激活,还可以引起β-arrestinl依赖性的受体泛素化下调。3.CP单独可引起β -arrestinl介导的ERK1/2磷酸化激活,说明CP具有IGF-1R的部分激动剂活性。4.GRK2和GRK6介导了CP诱导的ERK1/2磷酸化激活和受体下调证实了CP是IGF-1R的一种偏倚性配体。3.CP单独可引起β -arrestinl介导的ERK1/2磷酸化激活,说明CP具有IGF-1R的部分激动剂活性。4.GRK2和GRK6介导了CP诱导的ERK1/2磷酸化激活和受体下调证实了CP是IGF-1R的一种偏倚性配体。第二部分IGF-1R作为一种RTK/GPCR的功能杂合体的机制研究[研究目的]1.明确IGF-1R的1248及1291位丝氨酸在受体降解及下游信号转导中的作用；2.探索IGF-1R酪氨酸激酶结构域对受体降解及下游信号转导的影响;3.探索突变体质粒对细胞周期的影响。[研究方法]1. HEK-293T细胞中转染IGF-1R野生型(wt)、酪氨酸激酶结构域突变(TM)、1248和1291位丝氨酸单突变(48A、48D、91A、91D)和双突变(AD、AA、DD、DA)以及双突变与TM联合的三突变质粒。2.IGF-1刺激相应时间后,免疫印迹检测下游信号通路及受体的降解。3.IGF-1刺激细胞后,碘化丙啶染色,流式细胞仪检测细胞周期。[研究结果]1.IGF-1刺激后,免疫印迹结果提示wt转染细胞受体降解呈线性下降。AA、AD转染细胞受体基础降解少,而DA、DD转染细胞受体降解增多；但是AA、DA转染细胞IGF-1诱导的降解速率降低,而AD、DD转染细胞IGF-1诱导的受体降解速率明显增加。2.细胞转染TM质粒后,其受体表达水平与转染wt质粒的受体表达水平相当。而三突变体质粒转染后细胞受体降解机制与双突变体质粒相似,即1248位丝氨酸调控受体基础水平的循环,而1291位丝氨酸调节配体诱导的受体降解。3.IGF-1刺激后,免疫印迹结果提示wt转染细胞ERKl/2磷酸化在5分钟达峰值,随之逐渐下降；AD转染后细胞晚期ERK1/2激活增多,早期则降低；而DA转染细胞ERK1/2激活则与AD相反；而DD转染细胞早期及晚期ERK1/2均稍增多；相反的,AA转染后两相ERKl/2激活均降低；。4.细胞转染TM后其ERK1/2激活较未转染细胞总体尤其是早期明显偏弱。可能是TM与内源性IGF-1R形成杂化二聚体,阻碍了内源性IGF-1R的信号转导。三突变体质粒转染细胞后ERK1/2激活的机制与双突变质粒相似,即1248位丝氨酸调节ERK1/2第一相激活,而1291位丝氨酸调节第二相激活。[结论]1.IGF-1R的C端1248位丝氨酸调节ERKl/2的第一相活化,而1291位丝氨酸调控ERK1/2第二相活化。2.IGF-1R的C端1248位丝氨酸调节受体的基础循环回收,而1291位丝氨酸调控配体诱导的受体降解。3.IGF-1R的酪氨酸激酶结构域突变体与IGF-1R/GPCR串话相互独立。值,随之逐渐下降；AD转染后细胞晚期ERK1/2激活增多,早期则降低；而DA转染细胞ERK1/2激活则与AD相反；而DD转染细胞早期及晚期ERK1/2均稍增多；相反的,AA转染后两相ERKl/2激活均降低；。4.细胞转染TM后其ERK1/2激活较未转染细胞总体尤其是早期明显偏弱。可能是TM与内源性IGF-1R形成杂化二聚体,阻碍了内源性IGF-1R的信号转导。三突变体质粒转染细胞后ERK1/2激活的机制与双突变质粒相似,即1248位丝氨酸调节ERK1/2第一相激活,而1291位丝氨酸调节第二相激活。[结论]1.IGF-1R的C端1248位丝氨酸调节ERKl/2的第一相活化,而1291位丝氨酸调控ERK1/2第二相活化。2.IGF-1R的C端1248位丝氨酸调节受体的基础循环回收,而1291位丝氨酸调控配体诱导的受体降解。3.IGF-1R的酪氨酸激酶结构域突变体与IGF-1R/GPCR串话相互独立。第三部分IGF-1R单克隆抗体治疗肿瘤的不良反应概述[研究目的]靶向IGF-1R治疗实体肿瘤是近十余年来的一个研究热点,而针对IGF-1R的单克隆抗体是其中发展较快的一个分支。本研究的目的是系统性综述IGF-1R单克隆抗体在治疗肿瘤中的不良反应事件。[研究方法]在Pubmed数据库中检索’IGF-1R monoclonal antibody’的相关文献共389篇。经过详细的筛选后有15篇临床研究纳入了下述的分析。我们收集了各种报道的不良反应及其发生率,并计算其总体的发生率。随后根据年龄分组,我们比较了不同年龄组之间、单抗单独及与化疗药物合并、各单抗之间不良反应发生率及种类的差异。[研究结果]低年龄组中单抗治疗的不良反应较高龄组患者较多且重,19种不良反应中的13种不良反应发生率在单独用药中较联合用药者为低(P<0.05)。接受R1507治疗患者的不良反应发生率要显著高于cixutumumab和figitumumab.[结论]选择合适的单抗药物及联合的化疗药物是IGF-1R单抗治疗肿瘤的关键。低年龄组患者在使用单抗时应特别注意不良反应发生。另外我们应该注意到某些特定的单抗倾向于发生特定的不良反应。