论文部分内容阅读
研究背景:急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是由多种因素引起的肺泡上皮细胞和微血管内皮细胞损伤导致的非心源性肺水肿和低氧血症,极大地危害了人类的生命健康,是造成重症患者死亡的重要原因。肺水肿是ALI最显著的病理生理改变之一,及时有效地完成肺泡液体清除（alveolar fluid clearance,AFC）对ALI预后至关重要。研究发现,ALI时钠水主动转运系统损伤是导致AFC障碍的根本原因,而上皮钠通道（epithelial sodium channel,ENa C）和Na,K-ATP酶（Sodium,potassium-ATPase,Na,K-ATPase）在肺泡液体清除过程中扮演重要角色。磷脂酰乙醇胺结合蛋白4（phosphatidylethano-lamine binding protein 4,PEBP4）属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白（phosphatidylethano-lamine binding protein,PEBP）家族,在哺乳动物多种组织中广泛表达,其独特的结构域使之具有多种功能。文献报道,PEBP4具有抗细胞凋亡的功能,参与癌症的发生发展。PEBP4还具备抗炎效应,而炎症的发生和消退对于ALI发展至关重要。值得一提的是,最新研究报道PEBP4被鉴定为Ⅱ型肺泡上皮细胞的新标志物。此外,血清PEBP4含量与Na+浓度呈负相关,而AFC的源动力正是Na+跨细胞膜的主动转运。以上均提示PEBP4可能通过调节AFC而在ALI的发生发展过程中发挥作用。为此,本课题拟研究PEBP4对AFC和ALI的影响及其具体机制。目的:探究PEBP4对急性肺损伤的影响及其作用机制。实验方法:1、构建并繁殖PEBP4 KO（knockout,KO）小鼠,进行鉴定和表型分析。2、检测急性肺损伤的程度。利用H＆E染色和小动物micro-CT仪观察肺组织病理和影像学变化;试剂盒检测肺组织MPO活性,血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌水平以及Western Blot检测COX-2的表达水平评估炎症反应程度;检测肺组织湿重/干重比和肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中总蛋白浓度评估肺水肿和肺泡上皮-内皮屏障损伤程度3、检测肺泡液体清除能力和PI3K/AKT信号通路的活化水平。利用Western blot检测肺组织匀浆液中ENa C-α、β、γ亚基以及Na,K-ATPaseα1、β1亚基的蛋白表达水平,同时检测PI3K和AKT的磷酸化水平。实验结果:1、Western blot结果显示:WT小鼠气管滴注LPS后肺组织PEBP4蛋白表达水平明显降低,提示PEBP4与急性肺损伤存在关联性。琼脂糖凝胶电泳和Western Blot结果显示:PEBP4基因和蛋白未在PEBP4 KO小鼠的鼠尾和肺组织中表达,表明成功构建PEBP4 KO小鼠。H＆E染色及小动物micro-CT表明敲除PEBP4对肺组织的结构没有明显影响。2、敲除PEBP4加重肺泡结构破坏、融合、出血、炎症细胞浸润、肺实变及肺水肿程度;增加BALF总蛋白浓度和MPO活性;促进炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌及COX-2表达。3、敲除PEBP4抑制PI3K/AKT通路活化,p-PI3K和p-AKT的表达水平显著下降,同时抑制ENa C-α和γ以及Na,K-ATPaseα1和β1的表达水平。4、PI3K特异性激活剂740YP和AKT特异性激活剂SC79均可部分逆转敲除PEBP4所产生的效应。包括减轻肺组织损伤程度,促进肺泡液体清除,增加钠水转运系统的表达水平,以及活化PI3K/AKT通路。结论:PEBP4缺失导致肺泡液体清除障碍加重LPS诱导的急性肺损伤,此效应可能通过抑制PI3K/AKT通路而实现。