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热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)是生物在不利条件下产生的一种保护机体的蛋白,具有重要的病理、生理功能。在正常时以较低水平表达;在环境温度变化、炎症、发热、微生物感染、肿瘤、放射等情况下均诱导其合成,从而减轻不利条件下导致的损害。近年研究发现,HSP70在肿瘤发生、发展中充当了多重角色,一方面作为“分子伴侣”参与肿瘤细胞的功能代谢,保护肿瘤细胞免受有害因素的损害;另一方面作为肿瘤细胞与机体正常细胞生长、代谢、分化的异质性,使HSP70成为与其相结合的肿瘤抗原多肽的靶载体,在参与肿瘤抗原的免疫反应中充当了免疫佐剂的作用。RNA干扰(RNAi)是一种转录后基因沉默(Post-transcriptional gene silence,PTGS)的基因阻断技术,近年来被广泛应用于哺乳动物细胞抑制基因表达。通过RNase III内切酶Dicer的作用产生有活性的小的21-23nt干扰性RNA(short interence RNA, siRNA),介导其互补同源mRNA序列的特异性降解,沉寂目的基因的表达。本课题采用RNAi技术,设计并合成针对HSP70基因的siRNA,转染胃腺癌细胞株SGC-7901,并进行裸鼠皮下移植瘤实验,检测HSP70 mRNA水平和蛋白水平表达的变化;观察siRNA对胃癌细胞生长的影响;为胃癌的基因治疗探索新的方法。目的:构建绿色荧光蛋白(GFP)的短发夹状RNA(shRNA),观察其在胃癌细胞中抑制外源GFP的表达作用,为下一步设计Hsp70基因的siRNA提供技术支持。方法:设计、合成含GFP编码基因片段的siRNA,与转录载体pTZU6+1连接,构建pshRNA -GFP重组质粒;重组质粒pshRNA -GFP与pEGFP-C1共转染胃癌细胞株BGC-823和SGC-7901,检测pshRNA -GFP对GFP表达的影响。结果:成功构建针对GFP的siRNA重组载体pshRNA-GFP,并经序列分析验证;应用荧光显微镜证实重组载体pshRNA-GFP对共转染的pEGFP-C1中绿色荧光蛋白的表达有明显的抑制作用,明显高于对照组,抑制率大于70%;Western blot检测结果表明应用pshRNA-GFP作用后GFP蛋白表达明显减少。结论:构建的pshRNA-GFP重组质粒能有效地抑制GFP基因在胃癌细胞中的表达。目的:构建Hsp70的短发夹状RNA(shRNA),检测其在胃癌细胞株SGC-7901中对Hsp70基因表达的抑制作用。方法:根据Hsp70编码基因,设计并合成3对反向重复序列,分别定向克隆至载体pTZU6+1的U6转录启动子下,构建pshRNA-Hsp70质粒及对应的点突变质粒pshRNA-Hsp70’,分别转染胃癌细胞株SGC-7901,采用RT-PCR和Western blot检测pshRNA-Hsp70和pshRNA-Hsp70’对Hsp70基因表达的抑制作用。结果:酶切电泳分析和DNA测序证实重组质粒pshRNA-Hsp70和pshRNA-Hsp70’构建成功;pshRNA-Hsp70对内源Hsp70基因的表达有明显的抑制作用,明显高于对照组;pshRNA-Hsp70’对目的基因基本无抑制作用。结论:构建的重组质粒pshRNA-Hsp70能特异而有效抑制内源性Hsp70基因在SGC-7901细胞中的表达,为下一步研究siRNA对胃癌细胞生长的影响打下基础。目的:利用RNAi技术在胃癌SGC-7901细胞裸鼠皮下移植瘤内抑制Hsp70表达,探讨pshRNA-Hsp70在体内对肿瘤生长的作用。方法:将胃癌细胞株SGC-7901注射入裸鼠皮下,建立裸鼠皮下移植瘤模型。pshRNA- Hsp70导入胃癌组织中,在体内诱导RNAi,采用RT-PCR和Western blot检测Hsp70基因表达的变化.并观察肿瘤体积的变化。结果:pshRNA-Hsp70导入裸鼠皮下移植瘤后15d,与对照相比,Hsp70的mRNA和Hsp70蛋白显著下调;且肿瘤体积明显缩小。结论:RNA干扰明显抑制了靶基因Hsp70的表达,对肿瘤生长有明显抑制作用。