近年来由于抗生素的不规范使用等多种原因，细菌耐药问题日益严重，人 们正努力从各个方面来解决，其中机体天然产生的抗菌肽(antibacterial peptide) 由于其对耐药菌的强大抗菌作用而受到人们的关注。抗菌肽是一种阳离子小分 子多肽，在天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。防御素(defensin)是 抗菌肽中较为重要的一种，主要来源于皮肤、呼吸道等的上皮组织，是正常机 体抵抗外界病原微生物入侵的重要防线。 为了构建具有广谱高效的抗菌肽基因，获得新型抗菌融合蛋白，本实验采 用了改进的重叠区基因拼接法对牛的β防御素3(BNBD3)cDNA和人的α防 御素3(HNP3)cDNA分别加以改造。在去除BNBD3的终止密码子和HNP3 的起始密码子的基础上，在BNBD3的5’端引入BamHI酶切位点，并在HNP3 的3’端引入EcoRI酶切位点，同时在二者之间加上Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser柔 性连接肽序列。利用多次PCR扩增出目标片段，并构建了 pGEX-4T-1-BNBD3／HNP3原核表达载体，经质粒PCR以及BamHI／EcoRI双酶 切鉴定，测序结果证实：BNBD3／HNP3融合基因已成功克隆至原核表达载体 pGEX-4T-1。 将已构建的BNBD3／HNP3融合蛋白表达载体质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，用2×YT培养基培养，以IPTG诱导融合蛋白表达，经SDS-PAGE分 析表达蛋白分子量符合预期的34.9KDa。融合蛋白的表达产物在细胞破碎的上 清中以可溶形式存在，将带有GST标签的融合蛋白用亲和层析法纯化。融合蛋 白在体外抗菌实验中表现出了明显的抑制大肠杆菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球 菌和肺炎球菌生长的抗菌活性(P<0.05)，表明我们所构建的。BNBD3／HNP3融合抗菌肽是一种新型的具有抗菌活性的蛋白，为开发抗感染制剂或抗生素替代品奠定了基础。 将已构建的BNBD3/HNP3 融合蛋白表达载体质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，用2xYT培养基培养，以IPTG诱导融合蛋白表达，经SDS-PAGE分析带有GST标签的表达蛋白分子量符合预期的34.9KDa。融合蛋白的表达产物在细胞破碎的上清中以可溶形式存在，将大量表达的蛋白用亲和层析法纯化。融合蛋白在体外抗菌实验中表现出了对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎球菌和绿脓杆菌的抗菌活性。表明我们所构建的BNBD3/HNP3 融合抗菌肽是一种新型的具有抗菌活性的蛋白，为开发抗感染制剂或抗生素替代品奠定了基础。