钾和氮都是植物正常生长所必需的大量营养元素,主要通过根系从土壤中获取。我国耕地土壤中钾素和氮素含量普遍较低,在农业生产中,长期以来主要通过施用大量的氮钾肥料以满足植物生长发育需要,提高作物产量和品质；但长期大量施肥容易导致土壤及水质污染,造成严重的环境污染问题。本研究一方面通过筛选较耐低钾胁迫基因型烟草品种,并使用抑制消减杂交(SSH)技术鉴定其低钾胁迫响应基因,探讨烟草响应低钾胁迫的分子机理,为提高植物耐低钾能力的遗传操作发掘新的基因资源；另一方面通过植物基因工程技术将植物氮代谢和钾吸收过程中的相关基因在烟草中过量表达,探讨植物吸收利用氮钾营养机理,为进一步利用基因工程手段获得高效吸收富集氮钾营养作物的研究提供技术支持。1、选取74种基因型烤烟品种为试验材料,在无菌条件下进行高(20mM)、中(2.5mM)、低(50州)三种钾浓度梯度试验,研究比较各基因型烤烟的钾素营养特性,以筛选耐低钾胁迫的富钾基因型烟草品种。结果表明,低钾胁迫严重影响烟草生长,造成地上部鲜重、干重以及水分含量降低。高钾条件下,烟叶平均含钾量为3.114%,随着钾浓度的降低,烟叶含钾量显著降低,中钾和低钾条件下烟叶的平均含钾量仅为1.965%和0.140%,但不同品种间含钾量差异增大,变幅由高钾时的0.599增至低钾时的0.623,由此认为,低钾条件更有利于富钾基因型烟草品种的筛选鉴定。通过对74种烟叶含钾量进行Ward聚类分析最终鉴定出22种富钾基因型烤烟,45种高钾基因型烤烟和7种低钾基因型烤烟,各基因型烤烟叶片含钾量在同一供钾条件下有一定差异,但与根系活力呈明显正相关。选择一种富钾基因型烟草——中烟98,对其在低钾胁迫下的生理特性进行进一步分析表明,其根系中钾离子含量、过氧化氢含量以及叶片中的可溶性蛋白含量在低钾处理初期显著降低,与此同时,叶片中的可溶性糖、脯氨酸及丙二醛含量显著升高,因此认为其对低钾胁迫作用敏感,且具有一定抗低钾胁迫能力,故此本研究选择中烟98作为烟草低钾胁迫SSH文库构建试验材料。2、利用SSH技术构建中烟98在50μM低钾胁迫条件下的正向SSH cDNA文库。挑选片段大于300bp的232个克隆进行测序,获得203条表达序列标签(EST)。序列重复性分析表明,32.6%的EST只有一次重复,其余67.4%的EST有2-5次重复,重复出现频率较高的EST是细胞色素P450,磷脂酶A1,金属硫蛋白,热激蛋白以及硝酸还原酶。Blastx分析显示全部的203条EST序列中有107条非冗余基因,其中包括未知功能序列57条,已知功能基因50条。50条己知功能的EST序列按照功能可聚为6种类,其中包括与胁迫和细胞死亡、代谢、信号转导及转录因子等相关基因。挑选包括钙网蛋白、热激蛋白、乙烯应答元件结合因子等16个基因进行半定量RT-PCR分析,结果表明所选基因在低钾胁迫后均有不同程度的上调表达。SSH cDNA文库提供的信息为阐明中烟98富钾营养的分子机制提供了重要线索,并为今后植物钾素营养基因工程操作提供了新基因资源。3、通过基因工程技术,分别构建了拟南芥钾离子转运体AtKUP1和通道蛋白AKT2的植物表达载体,并将其在烟草中过量表达,比较供钾充足及钾素缺乏时转基因烟草中钾离子、叶绿素、可溶性蛋白及多种碳水化合物含量的变化,并结合植株的生长差异,探讨这两种K+转运蛋白在植物钾素营养中的作用。结果表明：高钾条件下,转基因烟草的长势与多种生理学指标与野生型烟草相比,并未有明显差异,这可能是由于钾素营养过剩时,植物通过自身具有的K+吸收调控机制来控制K+的吸收量,以保证作物生长发育的需要；但当外部钾素营养缺乏时,转基因烟草就表现出明显的生长优势,不仅表现在株高、地上部鲜重、干重、叶表面积等方面,而且表现在低钾诱导了转入的外源基因表达水平的升高,促进了叶绿素合成,提高了钾离子、可溶性蛋白、葡萄糖、蔗糖含量以及SOD酶活性等方面,与此同时,低钾造成了可溶性糖、还原性糖含量,以及与胁迫相关的脯氨酸、丙二醛和过氧化氢含量的显著降低。这些结果一方面表明低钾胁迫影响了植株正常的生长发育,启动了植株的胁迫应答机制,引起了多种中间代谢产物含量的变化；另一方面,外源AtKUP1或AKT2基因的转录可促进低钾胁迫下植物对钾素的吸收和转运,减轻了低钾胁迫对植物造成的损害。4、将组成型启动子(CaMV35S)控制下拟南芥转录因子DofI的植物表达载体pK2-35S-Dofl,以及特异性光诱导启动子(Rubisco小亚基的启动子PrbcS)控制下DofI、细胞质型谷氨酰胺合成酶GSl和叶绿体型谷氨酰胺合成酶GS2基因的3种植物表达载体pPZP221-PrbcS-Dofl、pH2-35S-PrbcS-GS1和pK2-35S-PrbcS-*T-GS2,单独或同时在烟草中过量表达,获得WD, WRD, WG1, WG2, WG12, WDG1, WDG2和WDG128种转基因烟草。通过考察转基因烟草在低氮胁迫下的生长状况和多种生理指标的变化,探讨其低氮胁迫耐受性。研究结果表明在筛选的转基因株系中,外源Dof1,GSI或GS2基因都有一定水平的表达,转基因植株的长势比对照好；氮代谢过程中的关键酶GS和NR,以及碳代谢过程中的关键酶PEPC和PK的活性增强,葡萄糖,蔗糖以及多种氨基酸含量明显增加,硝态氮、苹果酸、柠檬酸含量显著降低；转基因烟草的氮素利用率(NUE)明显高于对照烟草,且以Dofl和GS共同表达的转基因烟草最为明显。这些发现表明Dofl和GS基因的单独或同时过量表达都能够提高烟草的氮素利用率,促进烟株生长,且转双基因的效果优于单基因。因此认为本研究采用Dofl转录因子和GS蛋白共同表达的策略为增强植物低氮胁迫耐受能力的研究提供了一种新途径。