玉米非特异性转脂蛋白的克隆、表达及钙调素结合活性研究

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本研究室曾从白菜中分离了一种新的钙调素结合蛋白,CaMBP-10,它与CaM 的结合具有不依赖于 Ca<2+>的特性,即在有Ca<2+>和无Ca<2+>条件下均能与CaM 结合。由于该蛋白与植物转脂蛋白家族成员同源性非常高,且其理化性质和生物学活性也与植物转脂蛋白非常类似,故我们确认其是植物非特异性转脂蛋白家族(nsLTPs)的新成员.近期研究证明,拟南芥nsLTP也与CaMBP-10具有相同的CaM结合性质,这说明植物转脂蛋白可能是一种新的CaMBP,为证明CaM参与植物转脂蛋白功能的调节提供了直接证据。 为进一步证明 nsLTP与CaM结合的普遍性,揭示二者相互作用的机制,本文从提取植物总RNA开始,克隆并表达了单子叶植物玉米的非特异性转脂蛋白(Zm-nsLTP)。CaM 凝胶覆盖(CaM-gel overlay)分析和CaM-Sepharose下拉(pull-down)实验结果表明 Zm-nsLTP 不仅具有CaM结合活性,且其不依赖于Ca2+的CaM 结合特性与CaMBP-10和拟南芥非特异性转脂蛋白(At-nsLTP1) 也完全相同。用基因删除和缺失突变的方法研究玉米非特异性转脂蛋白与CaM结合的结构域(CaM-binding domain,CaMBD),结果表明Zm-nsLTP 的 CaMBD 为 47~60 位氨基酸序列。蛋白质二级结构预测显示,该序列为BAA结构,与已发现的大多数CaMBP的CaMBD的特征一致。为证明植物转脂蛋白是一类新的CaMBP提供了又一证据。同时,我们以P-96为探针,研究了CaM对Zm-nsLTP脂结合活性的影响,进一步证明了二者之间的相互作用。
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