目的先天性巨结肠（HD）发病率高，居先天性消化道畸形第二位，是小儿外科领域研究的热点。病理学研究发现病变段有神经节细胞缺乏、多种类型的神经纤维异常增生以及肠壁起搏细胞的异常，这些形态上的异常表明肠神经系统发育缺陷可能是先天性巨结肠发病的原因，但如何出现肠神经系统的发育异常，其病因并不明确。本课题采用免役组织化学方法研究层粘连蛋白（LN）、层粘连蛋白受体（LNR）、纤维粘连蛋白（FN）在先天性巨结肠病儿狭窄段、移行段、正常段的表达；通过RT-PCR、荧光定量PCR对层粘连蛋白基因、RET基因在先天性巨结肠病儿狭窄段、移行段、正常段的表达以及层粘连蛋白基因与RET基因表达的相关性进行研究，探讨先天性巨结肠肠壁微环境改变对肠道神经系统发育的影响，以及这些改变与RET基因的相关性，旨在探讨先天性巨结肠的病因。方法标本取自山东大学齐鲁医院小儿外科2004年均经病理证实的27例HD病儿，以狭窄段为无神经节细胞段，查见有神经节细胞的移行段为有神经节细胞段，扩张段近端为正常段，分别取200mg新鲜标本放入无菌试管中于负84℃冰箱中保存，另取新鲜组织用10％福尔马林固定，常规石蜡包埋。用二步法对27例HD患儿狭窄段、移行段、正常段肠壁组织进行免疫组织化学染色，RS Image成像系统照相，存盘，用JD801形态学图像分析软件判定LN、LNR、FN的阳性染色面积，用SPSS 11.5统计分析软件单因素方差分析法分别对LN、LNR、FN的阳性染色面积进行分析比较；用RT-PCR技术对层粘连蛋白mRNA及RET基因在三段肠壁的表达定性研究，美国alpha9900凝胶图像分析系统进行强度表达，计算相对系数，对平均相对系数用SPSS 11.5软件行单因素方差分析，对两基因在三段组织的表达进行半定量分析；用实时荧光定量PCR技术对层粘连蛋白基因及RET基因在三段肠壁的表达定量分析，对层粘连蛋白基因及RET基因以及内参基因的CT值采用7000型SDS应用软件相对定量2^-△△Ct法比较各基因的表达差异，并用SPSS 11.5软件双变量相关关系法分析两基因表达的相关性；从而推断LN、LNR、FN在狭窄段的表达以及两种基因表达的相关性与HD发生的关系。结果免疫组化阳性染色点为棕黄色颗粒，主要出现在粘膜层、粘膜下层和内环肌层的基底膜中，从粘膜下层到外环肌层呈梯度递减。正常段的有点线状棕黄色颗粒，而无神经节细胞段则明显加强，粘膜层、粘膜下层基底膜连续黄染，平滑肌间呈纤维网状。层粘连蛋白、层粘连蛋白受体及纤维粘连蛋白在狭窄段表达比正常段明显增高（P＜0.05），从正常段到狭窄段逐渐增高；提取的总RNA光密度值测定A260／A280值均在1.8-2.0之间。由RT-PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳的灰度值计算层粘连蛋白基因相对系数在狭窄段、移行段、正常段分别为：0.73±0.18、0.39±0.15、0.15±0.12，层粘连蛋白基因在狭窄段表达比正常段亦明显增高（P＜0.05）；实时荧光定量PCR发现层粘连蛋白基因在狭窄段表达是正常段的2倍，移行段是正常段的1.11倍，从正常段到狭窄段亦逐渐增高。RET基因在狭窄段、移行段、正常段表达的相对系数分别为：0.07±0.05、0.33±0.14、0.79±0.19，在狭窄段表达明显减低（P＜0.01）；实时荧光定量PCR发现RET基因在狭窄段的表达仅是正常段的0.07倍，移行段是正常段的0.41倍，从正常段到狭窄段逐渐降低。层粘连蛋白基因与RET基因的表达正好相反，相关系数为-0.638，P＜0.001，存在负相关关系。结论层粘连蛋白、层粘连蛋白受体、纤维粘连蛋白在无神经节细胞段表达明显增高，而且层粘连蛋白基因在无神经节细胞段表达亦明显增高，因而这些蛋白的增高是内在的，它引起肠壁神经脊细胞的过早分化、发育、成熟、定居导致结肠末端无神经节细胞症的发生，肠壁微环境的改变可能是HD的病因。RET基因在无神经节细胞段表达明显降低，层粘连蛋白基因与RET基因的表达呈负相关关系，两者的表达可能相互影响，对HD的形成可能存有某种内在的联系。