杯冠属线虫的分子鉴定及系统发育学研究

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随着人们对寄生虫病的不断研究和认识,发现圆线虫在马属动物体内的寄生十分普遍,以宿主的大肠为主要寄生器官,以消化液等作为主要的营养来源。圆线虫首先削弱动物个体的免疫能力,然后引起一系列的其它病症反应,严重的会导致染病个体的死亡,所以严重威胁着畜牧养殖业的生产。因此,圆线虫的预防和治疗显得尤为重要,而传统的形态学方法有时不能准确鉴定致病圆线虫,系统的、全面的分析成为圆线虫调查研究的方向。目前,国外学者对圆线虫的研究较为深入,已经有了较多的资料和数据,然而国内的研究情况,却并不容乐观。在国内,更多的仅限于形态学方面的研究,系统性的研究还相对缺乏,特别是在分子生物学研究方面,存在着许多的空白。本论文首次对4种杯冠属线虫(采自河南新乡地区驴体内)的形态及分子系统发育学方面进行研究。  本研究以寄生在驴体内的4种杯冠属线虫(小杯杯冠线虫(Cylicostephanuscalicatus),高氏杯冠线虫(C.goldi),长伞杯冠线虫(C.longiburs)和微小杯冠线虫(C.minutus))为研究对象,通过光镜观察和测量,并利用扫描电镜对虫体的体表结构做进一步的观察和描述,为杯冠属线虫的分类提供更加可靠的依据。本实验观测到的虫体形态结构,与以往研究记载相比较基本上是一致的。  通过对研究材料的DNA提取和序列测定,结果可知:杯冠属的4种线虫共获得6条rDNA-ITS序列(ITS+5.8S),通过多序列比对分析发现,全序列总长度为740-842bp,其中5.8S区碱基完全一致,长度均为153bp;所含变异位点共93个,占总位点13.53%-15.84%,简约信息位点共65个,占总位点9.4%-11.07%;其中ITS1区长为367-372bp,变异位点为32个,简约信息位点为23个;ITS2区长为215-320bp,变异位点为61个,简约位点为42个,ITS2区相比ITS1区变异性更大。结合从数据库中获得的该属内5个种的6条序列,ITS-1区和ITS-2区的G+C含量分别为:47.70%-48.66%和38.14%-40.78%。所测得的6条序列的经过两两比对分析得知,种间差异性(ITS1和ITS2)计算结果为:1.080%-7.77%和3.75%-48.16%。因此,该属种间的ITS1序列差异性较小,而ITS2序列的差异性较大;种内差异性结果为:0.00-0.27%和0.31-0.47%,由此可见,ITS序列的种内差异非常小。其中微小杯冠线虫比较特殊,与其它种类线虫的种间差异(6.43-7.77%和46.63-48.16%)明显大于其它各种间差异(2.17-1.08%和3.75-9.40%)。最后以马圆线虫为外群,结合Genebank中取得已记载的所有杯冠属线虫,共计13条序列,通过MegaS.0作遗传距离分析,构建MP和NJ发育树。结果显示,MP和NJ树的拓扑结构完全一致,共分为两大支,这两大支又各自有自己的小支分布。微小杯冠线虫在基部单独聚为一支,其他种类聚为一支,这说明微小杯冠线虫与其他种类的亲缘关系比较远,其它四种线虫的关系较近。而从其它四种线虫聚集情况看可知,与长伞杯冠线虫的亲缘关系由近及远,依次可表示为:高氏杯冠线虫,小杯杯冠线虫,双齿杯冠线虫。
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