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研究目的:根据最新的全球癌症统计,胃癌(gastric carcinoma GC)是世界第五大最常见的癌症类型,是癌症相关死亡的第三大原因。目前,虽然胃癌的发病率已趋于稳定,但晚期胃癌患者由于局部和远处转移率较高,预后和生存率仍较低。由于血管生成被认为是肿瘤生长和转移的重要促进因素,因此曾是阻断肿瘤生长的潜在治疗靶点。然而,一些抗血管生成药物在胃癌患者中尚未取得显著的临床效果,这一发现可能与肿瘤表现出不同血管形成模式的能力有关。血管生成拟态(vasculogenic mimicry VM)是一种新的肿瘤血供模型,是侵袭性癌细胞在缺乏内皮细胞的情况下产生的一种功能类似血管的通道。VM在大多数恶性肿瘤中都有观察到,此外,其与肿瘤的侵袭转移密切相关,因此VM被认为在与这些肿瘤相关的低生存率和不良预后方面具有重要意义。此外,传统的抗血管生成药物对VM的抑制作用很小,有时甚至会适得其反。因此,许多研究试图探索VM形成的潜在机制,并且确定了几个关键的调控因子,包括VE-cadherin、MMP2和MMP9等。此外,上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)被证实与VM形成有关。然而,GC中VM形成的分子机制尚不清楚,阐明这些机制可能为开发血管源性治疗提供新的途径。TAZ是Hippo信号通路中的下游效应分子,在多种肿瘤中被发现高表达,且与TEAD家族结合能够促进肿瘤的增殖、转移等,但TAZ在胃癌血管生成拟态中的作用机制尚未明确。本实验通过免疫组化、细胞实验及各种分子生物学实验等,分析探讨TAZ在胃癌血管生成拟态、上皮间质转化及肿瘤细胞干性形成中的作用,从而为胃癌的抗血管治疗提供新的见解。研究方法:一、研究人胃癌组织中TAZ及TEAD4之间的相关性及其与VM之间的关系。1.收集228例来自天津医科大学总医院及肿瘤医院的胃癌组织标本,其标本都经手术切除,并且由有资历的病理医师确诊,有完整的随访资料。通过对切片进行CD34/PAS双重染色及免疫组织化学染色,观察TAZ、TEAD4在胃癌中的表达水平和VM的存在情况,并且分析TAZ与TEAD4,VM及临床病理资料之间的相关性。此外,通过Kaplan-Meier方法进行相关指标的生存分析。2.利用免疫组化方法检测228例胃癌组织中VE-cadherin、E-cadherin、CD44的表达水平,并进一步通过卡方检验分析TAZ与VE-cadherin、E-cadherin、CD44的差异,用Pearson统计方法分析TAZ与VE-cadherin之间的相关性。二、体外实验探究TAZ在胃癌VM、EMT、CSC中的作用。1.通过Western blot检测四种胃癌细胞系(MGC803、MKN45、MKN28、MKN74)中TAZ本底的表达情况,并筛选两种细胞系。在相应的胃癌细胞系中分别转染TAZ上、下调质粒,并用嘌呤霉素筛选出相应的稳转细胞系。2.通过三维培养、划痕、迁移侵袭、MTT增殖、无血清悬浮成球培养等细胞功能实验检测TAZ对胃癌细胞成管、迁移侵袭、增殖及成球能力的作用。3.通过Western blot实验检测在胃癌细胞中上下调TAZ后,TEAD4,VM相关蛋白指标(VE-cadherin、MMP2、MMP9),EMT相关蛋白指标(E-cadherin、Vimentin、Snail),CSC相关蛋白指标(ALDH1、CD44、c-Myc、SOX2)表达变化的情况。并进一步用免疫荧光实验验证TAZ、TEAD4、VE-cadherin、E-cadherin、Vimentin、ALDH1、CD44在细胞中的定位与表达。4.通过共转染实验,在上调TAZ的胃癌细胞中同时下调TEAD4,以及在下调TAZ的胃癌细胞中同时上调TEAD4,应用Western blot及迁移侵袭、三维培养等细胞实验验证TAZ与TEAD4的相互作用关系。此外,通过Co-IP实验检测TAZ与TEAD4之间的蛋白互作关系。研究结果:一、人胃癌组织中TAZ、TEAD4呈高表达,且与胃癌患者不良预后相关,TAZ、TEAD4与VM呈正相关关系。1.在228例人胃癌组织标本中,TAZ蛋白呈阳性表达的有101例(101/228),TEAD4呈阳性表达的有95例(95/228)。TAZ、TEAD4表达与VM呈正相关。免疫组化与临床病理资料分析结果显示,TAZ与TEAD4主要高表达于细胞核中,且与肿瘤分级、TNM分期、转移相关(P<0.05)。Kaplan-Meier分析表明,TAZ、TEAD4阳性的胃癌患者预后较差(P<0.05)。Pearson相关分析表明TAZ的表达与TEAD4表达具有正相关关系(r=0.3331,P=0.000)。2.卡方检验结果显示,TAZ与VM相关指标VE-cadherin(χ2=10.525,P=0.001),CSC相关指标CD44(χ2=4.635,P=0.031)均呈正性相关,与EMT相关指标E-cadherin(χ2=1.282,P=0.039)呈负相关,差异具有统计学意义。二、在胃癌细胞中,TAZ通过与TEAD4相互作用促进胃癌细胞VM、EMT及CSC的发生。1.通过Western blot筛选出高表达TAZ的MGC803胃癌细胞系和低表达TAZ的MKN28细胞系。细胞功能实验结果显示,在上调TAZ表达后,MKN28细胞成管能力、迁移侵袭能力、伤口愈合能力、增殖能力以及成球能力均较对照组明显增强(P<0.05),相反,MGC803细胞下调TAZ后,其成管、迁移侵袭、伤口愈合、增殖及成球能力减弱(P<0.05)。2.Western blot与免疫荧光结果显示,上调TAZ的表达,VE-cadherin、MMP2、MMP9、Vimentin、Snail、ALDH1、CD44、c-Myc、SOX2蛋白表达也随之增多,E-cadherin表达较对照组减少(P<0.05)。下调TAZ的MGC803细胞系表现出相反的结果。3.免疫共沉淀实验结果表明,TAZ与TEAD4存在蛋白互作关系。为了进一步验证TAZ与TEAD4之间的相互作用,在MKN28上调TAZ的同时下调TEAD4的表达,并且在MGC803将TAZ下调质粒与TEAD4上调质粒共转染。Western blot结果显示,MKN28细胞TAZ上调与TEAD4下调共转染后,VE-cadherin、Vimentin、Snail表达减少,E-cadherin表达增加。相反,TEAD4的过表达增强了TAZ下调后MGC803细胞中VE-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表达,减少了E-cadherin的表达,而对照组没有观察到这种变化。4.细胞共转染后,MGC803-shTAZ细胞中TEAD4的过表达明显挽救了TAZ下调对成管、迁移侵袭的抑制作用,此外,TEAD4下调质粒转染抑制了TAZ过表达后MKN28细胞增强的成管及迁移侵袭能力。研究结论:1.在人胃癌组织中,TAZ、TEAD4与胃癌肿瘤分级,TNM分期,转移及VM相关,且与病人的不良预后相关。此外,在胃癌组织标本中,TAZ与TEAD4呈正相关关系。2.在体外,TAZ不仅促进胃癌细胞成管、迁移侵袭、增殖及成球能力,而且能促进VM、EMT及CSC的发生及相关蛋白的表达。3.在胃癌细胞中,TAZ通过与TEAD4相互作用,促进VM的形成。