皮肤是人体的天然屏障，对维持体内环境的稳定和阻止微生物入侵起重要作用。烧、创伤后，治疗的最终目标就是重建或恢复皮肤屏障功能，在达到这个目标前，一个性能优良的创面敷料可以暂时替代皮肤的部分功能，提供一个有利于创面愈合的环境，等待创面上皮化或过渡到重建永久性皮肤屏障。因此，研制一种既可作为暂时性敷料用于浅度创面、供皮区，以促进残存上皮再生，加速创面愈合，也可作为一种组织诱导材料，用于深度烧伤创面，重建真皮层，改善创面愈合外观与功能的烧伤创面覆盖物，引起越来越多的重视。利用组织工程技术构建真皮组织为近年来研究的热点，但无论是种子细胞的分离和培养，还是种子细胞与支架材料的共培养均在体外进行，存在一般组织工程化组织和器官构建固有的缺点。我们在对人发角蛋白(human hairkeratin，HHK)的机理研究和临床应用中总结发现：将可吸收生物支架材料植入体内后，材料本身对周围组织自身的种子细胞有激活(或称成体干细胞)作用，利用体内微环境和体内精确的调节机制，可“在体”诱导、分化和培养种子细胞，并构建相应的组织或器官。本研究在该理论的指导下，拟以HHK-胶原海绵为支架(敷料内层)，复合一种可作为药物(以虎杖为例)缓释载体的聚甲基丙烯酸羟乙酯(poly 2-hydroxyethyl methacrylate，PHEMA)(敷料外层)，探讨其在体内“原位”诱导周围组织细胞构建真皮的可行性。胶原海绵是由胶原蛋白制成的具有海绵状多孔结构的一类生物敷料，其显著优点在于具有良好的止血性能、亲水及吸水性，且黏附性好，可较长时间的用于创面覆盖。但单纯胶原膜存在易干裂、降解速率过快、机械强度小等缺点。有人将胶原与壳聚糖、透明质酸、纤维粘连蛋白等复合，可在一定程度上改善其性能，使促愈合效果更明显。HHK是人发的主要成分，由我们对人发进行序贯的、不同程度的、可控性物理、化学处理后获得。处理的人发，稳定的化学结构被破坏，可被降解、吸收。前期的实验证明其具有组织相容性好，能诱导机体组织再生、修复，可控性降解，储存、运输方便，原料来源充足等优点，是理想的组织工程支架材料。虎杖甙(Polydatin，PD)作为烧伤创面用药，具有促进结痂、抗感染等作用，能减少创面渗出，防止水分及电解质丢失，加快创面愈合。为用于二度烧伤较为理想的药物。PHEMA为合成的高分子聚合物，通过合成工艺控制有可能使其成为良好的药物缓释载体。可以包裹药物、保持膜的湿润，并在较长时间内缓释药物，不仅可以减少感染机会和减轻患者痛苦；以膜的形式覆盖创面，还可减轻创面的收缩和瘢痕增生。本实验设想：将Ⅰ型胶原先后与6—硫酸软骨素、戊二醛进行交联后，再与HHK网格复合，制成HHK—胶原海绵复合内层敷料，外层用PHEMA包裹PD的药物缓释载体膜。分两个层次对新型复合敷料进行生物活性的评价。第一部分人发角蛋白—胶原海绵的组织相容性和生物可降解性评价有关HHK的化学成分、性质，生物学性能，生物、组织相容性及HHK人工腱的生物力学性能等，我们的前期研究中已阐明，但其在皮肤组织工程中的应用尚鲜有报道。胶原海绵已广泛用作皮肤的支架材料，但其易收缩、机械强度小等缺点依然是亟待解决的课题。目的研究HHK—胶原海绵体内的组织相容性和生物降解性方法1、用可控性的物理、化学处理方法制备具有轻(Ⅰ)、中(Ⅱ)、重(Ⅲ)不同处理程度的三种HHK组分材料。2、用牛跟腱为原料，经酸溶解、抽提、离心、盐析等步骤制备Ⅰ型胶原(经SDS-聚丙烯酰氨凝胶(PAGE)电泳证实)，并与6—硫酸软骨素进行初交联。3、将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种组份的丝状HHK以3∶3∶4的比例编织成网孔大小为1×1mm~2的网格状支架，与Ⅰ型胶原蛋白一同置于模具内经真空冷冻干燥后成膜，制成HHK—胶原海绵膜。4、将HHK—胶原海绵复合膜置于0.25％的戊二醛溶液中浸泡再交联，反复漂洗后干燥备用。5、成品的胶原海绵经扫描电镜观察海绵状结构，测其孔径大小。6、实验设计和分组：将大小均为1×1cm~2的“三”种材料(实验组植入HHK—胶原海绵，阳性对照组单纯植入胶原海绵，阴性对照组不植入任何材料)分别埋植于21只SD大鼠背部皮肤的真皮与皮下组织之间，以背部正中线为轴，每只大鼠背部制作6处埋植区域(左右各3个)，每组2处。分别于术后3天、1周、2周、4周、6周、8周和12周，随机选取3只大鼠，行材料及其周围组织取材，常规H.E.染色、弹性蛋白染色及扫描电镜观察，分析材料的组织相容性、降解情况及对新生组织的血管化作用。结果1、HHK—胶原海绵膜材料特性SDS—PAGE电泳图谱分析所抽提胶原α1(Ⅰ)带的颜色深度是α2(Ⅰ)带的2倍。Ⅰ型胶原的三条螺旋链为[2α1(Ⅰ)]α2(Ⅰ)。两次交联后的HHK—胶原海绵膜0.1-0.2cm厚，质韧，有弹性，随形性好。扫描电镜观察：粗细不等的胶原纤维呈不规则立体多孔状结构，80％的孔径平均在150—200μm。2、HHK—胶原海绵膜的组织相容性和降解吸收1)移植后大体观察：各组均无创口感染、组织渗液或移植物排斥反应。取材见，移植物表面包裹有薄层的纤维囊，不易与周围的纤维组织分离开。2)移植后光镜下观察：HHK—胶原海绵和单纯胶原海绵植入早期均有较明显的炎症反应，以中性粒细胞和单核细胞为主；第2周，炎症反应明显减轻，实验组成纤维细胞增生活跃，分泌少量胶原，材料周围新生血管数量增多。HHK及胶原海绵开始降解；第6周，实验组分泌胶原纤维排列趋于整齐，表皮层愈合良好。HHK材料部分降解，胶原海绵基本消失。实验组醛复红弹性纤维染色可见细长条状弹性纤维；第12周，HHK材料完全降解。3)电镜下观察，第2周，实验组材料周围可见胶原纤维和弹性纤维；毛小皮降解、剥离：胶原海绵膜内可见血管断面。结论HHK—胶原海绵复合膜组织相容性和生物降解性良好，且降解产物对机体无毒、无免疫排斥反应。第二部分人发角蛋白—胶原海绵—聚甲基丙烯酸羟乙酯复合生物敷料对深Ⅱ°烧伤创面的促愈作用本实验设计将HHK—胶原海绵作为敷料内层，不用更换；将PHEMA／PD药物缓释载体膜作为敷料外层，具有保湿和缓释药物的作用可更换。通过与临床应用较广的戊二醛猪皮敷料作阳性对照，以无菌纱布作为阴性对照组，比较不同时期的创面形态学及新生组织的变化，创面愈合率及愈合时间。评价HHK—胶原海绵—PHEMA／PD复合生物敷料对深Ⅱ°烧伤创面的促愈作用及生物活性。目的研究HHK—胶原海绵—PHEMA／PD复合生物敷料对深Ⅱ°烧伤创面的治疗作用。方法1、PHEMA的合成以丙烯酸丁酯、丙烯酸甲酯为甲基丙烯酸羟乙酯的反应物，以过氧化苯甲酰为引发剂，经回流、滴加等步骤完成甲基丙烯酸羟乙酯的聚合反应。将PD按一定比例溶于乙醇，与制备好的聚丙烯酸羟乙酯载体充分混匀后成膜。将PHEMA／PD膜浸泡于500ml蒸馏水中，用紫外光谱仪于5min，10min，30min，1h，2h，4h，6h……不同时间点测定浸提液中PD的含量。2、大鼠深Ⅱ°烧伤动物模型用盛有85℃的热水，底径为1.5cm的小烧杯，紧贴于脱毛后的大鼠背部皮肤15s，制备大鼠深Ⅱ°烧伤动物模型(经病理切片证实)，以背部正中线为轴，每只大鼠左右各制作3个创面。3、实验分组创面制备后3天，对正中线一侧的3个创面行切痂、清洗消毒处理，同时分别覆以实验组(HHK—胶原海绵—PHEMA／PD复合生物敷料)、阳性对照组(戊二醛猪皮组)和阴性对照组(无菌纱布组)的三种敷料(以后统称创面处理)，另一侧如法炮制。PHEMA／PD和无菌纱布隔日换药，观察创面肉芽组织生长情况。术后以创面完全上皮化为标准，记录创面愈合时间，于7d，14d和21d计算创面愈合率。于切痂覆敷料后1周、2周、4周、6周和8周，分别随机选取3只大鼠，切取整个创面及其周围组织，行H.E.染色形态学观察、新生血管计数、胶原纤维及弹性纤维的免疫组织化学染色观察。取标本前，将制备的胶原海绵与医用药棉分别进行断尾止血实验，分别记录止血时间及出血量，比较二者的止血效果。4、数据分析用完全随机设计资料的方差分析方法比较3组的新生血管数和愈合时间。重复测量方差分析方法分析不同时间点的创面愈合率。用独立样本的非参数检验比较胶原海绵与医用药棉的止血时间和出血量。结果1、PHEMA／PD缓释实验48小时(h)时，吸光度值最大，其后维持恒定。说明PHEMA膜在0—48h随时间推移药物PD不断释放，48h释放完全。2、大体观察SD大鼠背部烧伤后，创口边缘的正常组织充血明显，创面轻度肿胀，无水泡，创面皮肤苍白无生机。伤后2—3日，创面坏死组织形成干硬的暗红色焦痂。2天后换敷料时，见实验组敷料均紧贴创面，湿度适宜。阳性对照组猪皮敷料仍呈灰白色，与创面贴附好，无浮动感。阴性对照组创面有少量渗血及渗液。3、光镜下形态学观察1)烧伤后48小时，大量组织变性坏死，表皮及毛囊上皮细胞肿胀或缺如，胞浆浓缩，核固缩，细胞界限不清。胶原纤维变性坏死，排列紊乱。2)创面处理后2周，各组创面肉芽组织灶形成，成纤维细胞增殖活跃，并分泌较细小的胶原纤维填充创面。实验组较阳性对照组更明显，阴性对照组次之。新生组织中可见新生的毛细血管，实验组、阳性对照组较阴性对照组多(P=0.003，P=0.022 P＜0.05)。3)实验组及阳性对照组在创面处理后4周均基本愈合，阴性对照组过半例数愈合。创面肉芽组织明显增厚。新生毛细血管增殖旺盛且管腔增大，阳性对照组更明显。4)第8周，三组创面均愈合良好。实验组及阳性对照组胶原纤维束改造塑形，无瘢痕形成趋势。阴性对照组愈合的表皮层细胞对合不好及真皮层组织排列紊乱。4、免疫组织化学法检测1)创面处理后2w，实验组创面真皮基质中，Ⅰ型胶原呈棕黄色细密条带状；且有少量被染成棕黄色细丝状的弹性纤维，阳性对照组不明显，阴性对照组中无弹性蛋白的阳性表达。2)第4周，实验组及阳性对照组均可见真皮基质中呈棕黄色粗大的条带或片状的Ⅰ型胶原的强阳性表达。且实验组弹性蛋白的阳性表达较第2周时增加。3)第6周，弹性蛋白的免疫组织化学显示，阴性对照组中仅见散在表达。5、创面愈合时间实验组与阳性对照组平均愈合时间的差异无显著性(P=0.387P＞0.05)，而实验组和阳性对照组的愈合时间均较阴性对照组平均愈合时间短(P=0.000 P＜0.05)。6、创面愈合率实验组和阳性对照组在第14和21天的愈合率均较阴性对照组高(p=0.000 P＜0.05)。实验组仅在第14天，愈合率较阳性对照组高(p=0.046 P＜0.05)。7、止血时间胶原海绵止血组的止血时间及出血量均小于医用药棉止血组(Z=-4.334 P=0.000 P＜0.05)(Z=-2.468 P=0.014 P＜0.05)。结论HHK—胶原海绵—PHEMA／PD复合生物敷料可能通过诱导真皮内未分化间充质干细胞分化为成纤维细胞，并活化成纤维细胞合成、分泌胶原蛋白和弹性蛋白等。刺激血管形成，在体内构建组织工程化皮肤，从而促进深Ⅱ°烧伤实验大鼠创面的愈合。若控制合成工艺，PHEMA作为药物缓释载体是可行的。