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1目的观察中药复方芪玉三龙方对小鼠LLC移植瘤生长的抑瘤作用,基于Wnt/β-catenin信号通路探讨该方药对非小细胞肺癌的作用靶点及其机制,为临床运用芪玉三龙方辅助治疗肺癌提供实验依据。2方法2.1模型构建采用LLC肺癌细胞株传代培养移植法构建肺癌移植瘤小鼠模型。取对数生长期细胞,胰酶消化,离心,收集细胞,稀释、调整细胞浓度为1×105/m L,吸取细胞悬液0.2 m L注射于C57BL/6小鼠左侧腋部皮下,构建小鼠移植瘤模型。2.2分组及给药方法将荷瘤小鼠被随机分为模型组,芪玉三龙方高、中、低剂量组（按临床成人日用量的4、2、1倍给药）,化疗组,联合组（芪玉三龙方+顺铂）,每组8只。接种第2天开始给药,具体如下:（1）模型组（M）:0.2 m L/10 g生理盐水灌胃21 d,每周一次腹腔注射生理盐水0.4m L;（2）化疗组（C）:0.2 m L/10 g生理盐水灌胃21 d,每周一次腹腔注射DDP溶液0.4ml;（3）芪玉三龙方高剂量组（QH）::80.48 g·kg-1·d-1中药药液灌胃21 d,每周一次腹腔注射生理盐水0.4 m L;（4）芪玉三龙方中剂量组（QM）:40.24 g·kg-1·d-1中药药液灌胃21 d,每周一次腹腔注射生理盐水0.4 m L;（5）芪玉三龙方低剂量组（QL）:20.12 g·kg-1·d-1中药药液灌胃21d,每周一次腹腔注射生理盐水0.4 m L;（6）联合组（CQH）:80.48 g·kg-1·d-1中药药液灌胃21d,每周一次腹腔注射DDP溶液0.4ml。2.3检测指标测量各组肺癌荷瘤小鼠瘤体的体积及质量,计算抑瘤率;电镜观察肿瘤细胞的超微结构变化。Western blot及RT-q PCR法检测Wnt/β-catenin信号通路Wnt系列蛋白、核心蛋白β-catenin及下游靶基因转录水平的变化。3结果3.1芪玉三龙方LLC移植瘤小鼠生存情况的影响模型组小鼠生存状态尚可;芪玉三龙方高、中、低三组小鼠精神状态、活动、饮食一直尚佳;化疗组小鼠生存状态最差,消瘦明显;联合组小鼠的生存状态明显优于化疗组,但较芪玉三龙方各组欠佳。3.2.芪玉三龙方对小鼠移植瘤瘤体质量、肿瘤细胞结构变化的影响肿瘤体积、肿瘤质量变化:化疗药对肿瘤体积、质量有显著改善作用（P<0.01）,芪玉三龙方对肿瘤体积及质量有一定的抑制作用,无显著差异（P>0.05）。联合组和化疗组的抑瘤率相当。肿瘤细胞结果变化:模型组呈现典型的恶性肿瘤细胞特征;芪玉三龙方各组出现凋亡特点,尤以高剂量组明显,出现凋亡小体;化疗组呈典型新月形凋亡;联合组核内染色质浓聚,边集,细胞器结构消失,坏死严重。3.3芪玉三龙方对小鼠移植瘤肿瘤细胞CD44V6、Survivin表达的影响与模型组相比:CD44V6、Survivin在芪玉三龙方高剂量组、化疗组及联合组具有统计学意义（P<0.05）;与低剂量组比较,除中剂量组外各用药组均具有统计学意义（P<0.05）;与化疗组比较,余用药组无统计学意义（P>0.05）。本研究结果提示CD44V6主要表达于肿瘤细胞的胞膜、胞核;Survivin主要表达于肿瘤细胞的胞浆、胞核。3.4芪玉三龙方对小鼠移植瘤肿瘤组织Wnt/β-catenin通路起始蛋白Wnt的影响与模型组比较,各用药组均具有显著差异（P<0.01）;与化疗组比较,芪玉三龙方中、高剂量组Wnt1、Wnt2、Wnt5a蛋白水平显著降低（P<0.01）、联合组Wnt1、Wnt2蛋白水平显著降低（P<0.01）。芪玉三龙方高剂量组抑制肿瘤生长作用较优,量效关系明显,其与顺铂联用有一定增效作用。3.5芪玉三龙方对小鼠移植瘤肿瘤组织Wnt/β-catenin通路相关胞质蛋白的影响与模型组相比,GSK3β、p-GSK3β、β-catenin各用药组均具有显著差异（P<0.01）;与低剂量组比较,芪玉三龙方高剂量组具有显著差异（P<0.01）;与化疗组比较,芪玉三龙方高剂量组、联合组具有显著差异（P<0.01）。芪玉三龙方和化疗药联用具有协同效应。3.6芪玉三龙方对小鼠移植瘤肿瘤组织Dvl-1、SFRP-2蛋白表达的影响与模型组相比,Dvl-1各用药组均具有显著差异（P<0.01）;与低剂量组比较,芪玉三龙方中剂量组、化疗组、联合组具有显著差异（P<0.01）;与化疗组比较,余用药组无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比,SFRP-2芪玉三龙方中剂量组具有差异（P<0.05）,高剂量组具有显著差异（P<0.01）;芪玉三龙方,各用药组均具有显著差异（P<0.01）;与化疗组比较,中剂量组、高剂量组均具有差异（P<0.05、P<0.01）。3.7芪玉三龙方对小鼠移植瘤肿瘤组织Wnt/β-catenin通路靶基因的影响c-myc m RNA:与模型组和低剂量组相比,芪玉三龙方中、高剂量组和化疗组具有显著差异（P<0.01）;cyclin D1 m RNA:与模型组相比,各用药组具有差异（P<0.05,P<0.01）;与芪玉三龙方低剂量组比较,中剂量组、化疗组具有显著差异（P<0.01）;Axin2 m RNA:与模型组相比,各用药组均具有显著差异（P<0.01）;与低剂量组、化疗组比较,芪玉三龙方中、高剂量组具有显著差异（P<0.01）。芪玉三龙方与化疗药合用具有协同效应。4结论4.1芪玉三龙方可改善LLC移植瘤小鼠的生存状态,抑制肺肿瘤作用温和,高剂量抑制肿瘤生长作用较优,有一定的量效关系;4.2与顺铂相比,单用芪玉三龙方的抑瘤作用温和,而与单用化疗药相比,芪玉三龙方联合化疗药具有协同作用,对肺移植瘤具有一定抑制作用;4.3芪玉三龙方抑瘤机制可能是该中药复方降低移植瘤小鼠肿瘤组织组织Wnt1、Wnt2、Wnt5a蛋白表达,影响了肺癌细胞Wnt蛋白与胞膜受体结合;调控肺癌组织GSK3β、p-GSK3β、β-catenin蛋白表达,可以降低了细胞核内的β-catenin-TCF复合物水平,从而影响Wnt/β-catenin通路下游靶基因c-myc、cyclin D1、Axin2的转录水平,最终影响肺移植瘤生长、侵袭转移;4.4芪玉三龙方可以通过调控Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达成为肺癌辅助治疗的一个有效途径,并在临床中得到理想的运用。