论文部分内容阅读
背景我国目前有9300万慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HB V)感染者,每年有30万人死于乙肝相关肝病。目前中国已上市的抗HBV药核苷(酸)类(nucleos(t)itde analogs, NA)类药物包括核苷类的拉米夫定(Lamivudine, LAM)、替比夫定(Telbivudine, LdT)、恩替卡韦(Entecavir, ETV)和核苷酸类的阿德福韦(Adefovir, ADV)、替诺福韦(Tenfovir, TDF)。NA药物能够有效抑制病毒,副作用小,但长期治疗过程中病毒易产生耐药变异。HBV耐药变异可引起病毒学突破和生化学突破,是抗HBV治疗失败或疗效不佳的重要原因,可以造成肝炎再发和肝病进展,甚至可引起暴发性肝衰竭导致患者死亡。本研究针对临床上HBV耐药变异中存在的难点和热点,综合利用临床大样本测序、动态随访、克隆测序、质粒瞬时转染细胞评价复制力和表型耐药特性等多种研究手段,重点对以往研究结果不够明确的HBV rtA181T、rtN238T 和 HB V基因型对耐药的影响进行了分析；同时,对以往争议较大的NA未治疗患者的预存耐药变异进行了研究。结果可以加深对我国临床实践中的HBV耐药变异情况的了解,向临床优化管理耐药变异提供重要依据。目的本研究旨在：①研究较大样本量NA经治慢性HBV感染患者rtA181T/sW172的临床流行情况,明确rtA181T变异的发生特点与临床意义。② 分析ADV非经典耐药变异的临床流行情况,对其中检出率较高的HBV变异毒株进行动态克隆分析和表型耐药检测。③ 阐明我国流行的HBV B基因型和C基因型病毒是否与耐药变异发生相关。④ 明确NA未治疗患者预存耐药变异的临床检出率,揭示预存耐药变异毒株的表型耐药特性和临床演变规律。方法(1)通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)直接测序法对18419例慢性HBV感染患者进行逆转录酶(reverse transcriptase, RT)基因测序,明确rtA181T/sW172各种变异形式所占比例,分析不同rtA181T/sW172变异形式患者HBV DNA和表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)水平的差异。(2)从第一部分病例中选取11143例单独应用NA药物治疗或未应用NA治疗的慢性HBV感染者,分析其7种ADV非经典耐药位点的变异情况,即rtV84M, rtS85A, rtV214A, rtQ215S, rt1233V, rtP237H和rtN238T：对1例rtN238T患者进行动态克隆测序分析;构建含有rtN238T+A181V、rtN238T、rtA181V和无耐药变异野生株的pTriEx-1.1-HBV载体,瞬时转染HepG2细胞,检测上清中的病毒复制中单位本以评价各病毒株的复制力和对核苷(酸)类似物的耐药性。(3)从第一部分病例中选取13847例经历过NA治疗的非肝癌(hepatocacinoma, HCC)患者,应用Mega 6软件构建系统进化树确定病毒基因型,分析不同基因型病毒中各种耐药变异的分布情况。(4)从第一部分病例中选取845例未经NA治疗的住院患者,确定原发性耐药变异的检出率；构建rtL80I+M204I、rtL180M+M204I 和 rtA181V+N236T3种变异株的pTriEx-1.1-HBV表达质粒,并进行复制力和表型耐药分析；克隆测序分析1例预耐药变异患者体内病毒的动态演变情况。结果(1)共检出750例(4.1%)rtA181T变异,其发生率呈逐年升高的趋势。发现rtA181T对应sW172共有9种变异形式,其中166例(22.1%)为sW172*单独存在,525例(69.9%)为sW172终止变异与野生株共存；不同sW172变异形式患者的HBV DNA水平和HBsAg水平并无差异。(2)在7种ADV非经典耐药变异中,rtN238T变异检出率在ADV治疗患者中显著高于应用其它NA药物治疗的患者。对1例患者动态克隆分析发现,发生rtN238T+A181V变异后,应用ETV治疗33个月,患者体内病毒全部转变为野生株。病毒株复制力检测结果显示rtN238T+A181V显著高于rtA181V (P<0.01)。表型耐药分析显示,与野生株比较,rtN238T+A181V 和 rtA181V变异株对ADV敏感性显著下降,rtN238T变异株对ADV敏感,但1tN238T+A181V变异株较rtA181V株的复制力显著提高。(3)LAM相关耐药变异发生率为HBV/C型显著高于HBV/B型(31.67% vs.25.26%)。整体来看ADV耐药变异在HBV/C和HBV/B型之间并无差异(8.96%vs.9.87%)；具体来看,rtA181V的发生率为HBV/C型高于HBV/B型(5.29% vs.1.36%),但rtN236T变异则相反(2.70% vs. HBV/B 6.54%)。ETV药变异也有类似的现象,整体来看ETV耐药变异在HBV/C和HBV/B型之间并无差异(4.32%vs.3.62%);具体来看,rtM204V/I+rt184/202的发生率为HBV/C型高于H1BV/B型(3.66%vs.2.16%),但rtM204V/I+rt250变异则相反(0.67% vs.1.46%)。多重耐药变异发生率也为HBV/C型显著高于HBV/B型(0.83%vs.0.35%),主要变异形式是rtM204V/I+rtA181V(0.72% vs.0.30%)。(4)共有17例(2.01%)NA未用药患者检出原发耐药变异,直序法和克隆测序法结果显示所有患者均为耐药变异株与野生株共存。通过克隆测序共发现了13种耐药变异株,包括rtL80I+M204I, rtL80I+M204V, rtL180M+M204I, rtL180M+M204V, rtM204I, rtM204V, rtL80I+L180M+M204I, rtL80I+L180M+M204V, rtA181V, rtA181V+M204I, rtA181T+N236T, rtA181V+N236T, and rtN236T。表型耐药分析显示2种LAM预存耐药变异株rtL80I+M204I 和 rtL180M+M204V与野生株相比,对LAM的耐药倍数都大于1000;1种ADV预存耐药变异株 rtA181V+N236T 对 ADV的耐药倍数为15.4。动态随访发现,预存耐药变异rtM204I在ETV治疗后在病毒池中的比例上升(20%→85%)。结论rtA181T变异株在临床患者中常与rt181非变异株共存,单独出现该变异未对HBsAg和HBV DN A水平有明显影响;rtN238T变异可以增加rtA181V经典耐药变异株的复制力,是1种ADV耐药相关的复制力补偿变异;HBV/C基因型患者更易发生LAM和多重耐药变异;在NA未治疗患者中,预存耐药变异的检出率并不高,该类患者开始NA治疗时耐药检测并非必要。