论文部分内容阅读
目的：研究内皮源性一氧化氮合酶（eNOS）基因多态性对eNOS表达、一氧化氮（NO）合成的影响，以及与脂多糖（LPS）诱导原代人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）活化、损伤异质性的关系。方法： HUVEC体外传代培养，采用PCR扩增目的片段、运用酶切及电泳分离手段进行基因多态性分析并进行测序鉴定。采用RT-PCR、Western Blot、ELISA及比色法等实验技术，研究生理盐水和LPS刺激下不同eNOS基因型HUVEC eNOS mRNA和蛋白质的表达、一氧化氮（NO）的合成；炎症介质肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）的分泌；以及内皮细胞损伤标记物血管假性血友病因子（vWF）、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、血管内皮钙粘蛋白质（VE-cadherin）的表达。结果：（1）eNOS894G→T基因型GG、GT、TT基因频率分别为181／222（81.5%）、38/222(17.1％)和3/222(1.4%)；eNOS内含子4ab VNTR基因型aa、ab、bb基因型频率分别为3/274(1.1%)、35/274(12.8%)和236／274（86.1%）。三种优势基因型单体为：GG／bb(67.3％), GT/bb(17.1%),和GG/ab(15.2%)。（2）与基因型GG比较，基因型GT eNOS mRNA、蛋白质基础表达值低且NO合成少。LPS刺激后，两种基因型eNOS的表达和NO合成均显著下降，但基因型GT下降幅度更加显著（p<0.05）。基因型GT HUVEC分泌TNF-α、IL-6和表达vWF、VCAM-1基础值显著高于、而VE-cadherin基础表达水平显著低于基因型GG细胞。LPS刺激后，两种基因型HUVEC分泌TNF-α、IL-6和表达vWF、VCAM-1、VE-Cadherin水平与基础值比较均有显著差异。但GT型细胞IL-6升高的幅度显著高于GG型细胞（p<0.05）。eNOS内含子4ab VNTR基因型ab与bb对eNOS mRNA、蛋白质表达和NO合成；炎症介质TNF-α、IL-6分泌及表达血管内皮损伤标志物vWF、VCAM-1和VE-Cadherin水平的影响也呈现与eNOS894GG、GT基因型相似的基础水平和LPS刺激后的异质性变化。三种基因型单体中，GT/bb单体eNOS表达和NO合成的基础值最低（p<0.05）。LPS刺激后，该单体受影响更加显著，而且引起炎症介质（TNF-α、IL-6）的释放和血管内皮损伤标志物（vWF、VCAM-1）表达的升高幅度更大、细胞结构完整性标志物VE-Cadherin更加显著地降低。结论：eNOS894G→T和内含子4ab VNTR基因多态性均影响原代HUVEC eNOS表达和NO合成。eNOS894GT、eNOS4bb基因型以及eNOS GT/4bb基因单体HUVEC eNOS基础表达水平低，在LPS刺激下，与其它基因型和基因单体HUVEC比较，eNOS表达和NO合成减少的程度更加显著，可能是导致LPS诱导HUVEC活化和损伤异质性的重要因素。