成熟的哺乳动物红细胞没有细胞核,缺乏合成蛋白质、脂质的能力,其活动所需的能量依靠葡萄糖的酵解来供给,细胞的结构相对简单,是研究细胞膜结构及其功能比较理想的模型之一。人红细胞的平均寿命约为100¹20天,在此期间,一个红细胞可在组织和肺脏之间往返大约5¹0万次。红细胞大约有1/4的生命期需要挤过狭窄的毛细血管,完成氧和二氧化碳的装卸。红细胞的双凹碟盘形可以很好的适应其所需要遭受的变形。经过周期性的工作后,衰老的红细胞主要被脾、肝、骨髓等处的巨噬细胞吞噬分解。巨噬细胞对凋亡细胞的识别主要通过其表面的受体来进行的。巨噬细胞表面介导凋亡细胞识别及粘附的受体分子主要有玻璃粘连蛋白受体（整合素α_vβ₃）、磷脂酰丝氨酸受体、清道夫受体等。在对主要的红细胞膜蛋白氨基酸序列进行分析研究时发现,α血影蛋白,锚蛋白和带4.2蛋白都含有RGD（Arg-Gly-Asp）序列。RGD序列可以和约11种整合素结合介导细胞内或细胞间的粘附,从而调节细胞的迁移、分化和细胞凋亡。相关报道中,更多提到的是RGD序列和整合素α_vβ₃之间的粘附。α血影蛋白和锚蛋白是保守性非常强的蛋白质,在红细胞结构和功能上具有举足轻重的作用,因此,我们希望了解含有RGD序列的膜蛋白是否可以和整合素α_vβ₃发生相互作用,参与巨噬细胞对衰老或疾病红细胞的识别。论文利用蛋白质组学技术和流式细胞术等对红细胞膜蛋白在红细胞程序性死亡过程中介导细胞间的粘附行为进行了系统研究。首先通过Far-Western blot技术,证实了红细胞囊泡中含有RGD序列的红细胞膜蛋白中的一种或两种膜蛋白能与整合素α_vβ₃产生相互作用。然而,锚蛋白和α血影蛋白分子量比较接近,分别采用纯化的锚蛋白和血影蛋白进行研究,结果证明锚蛋白可以单独与整合素α_vβ₃结合。考虑到免疫印迹实验中含有的去垢剂可能对实验结果准确性的影响,论文采用了生物磁珠技术进一步验证了天然构象的蛋白质与整合素间的结合能力,实验结果表明,在生理条件下,锚蛋白和整合素之间仍然有结合能力。锚蛋白是红细胞膜内在蛋白,只有当其位于细胞膜外侧且RGD序列也暴露在蛋白质表面时,才有可能被巨噬细胞表面的受体分子所识别。论文采用体外模拟实验对锚蛋白在红细胞死亡过程中暴露到红细胞膜的表面的机制进行了研究,同时由于磷脂酰丝氨酸外翻是细胞程序性死亡过程中主要的“死亡信号”,对磷脂酰丝氨酸的外翻情况也做了相应的检测。结果表明:在外加流体剪切力和钙离子的共同作用下,磷脂酰丝氨酸和锚蛋白均可以外翻到红细胞表面,但荧光信号分布的差异表明锚蛋白的外翻机制可能不同于磷脂酰丝氨酸。为了验证外翻的锚蛋白和整合素α_vβ₃的结合可以介导红细胞和巨噬细胞的粘附,论文采用了抑制实验,即用整合素α_vβ₃、annexin V和锚蛋白封闭红细胞膜上或巨噬细胞表面可能的结合位点后检测红细胞和巨噬细胞的粘附。结果表明,封闭相关结合位点可以显著降低巨噬细胞和红细胞粘附的数量,锚蛋白的外翻可能是一个新发现的衰老红细胞识别机制。论文还对正常红细胞和基因敲除小鼠模型（带3蛋白、锚蛋白、带4.2蛋白及原肌球调节蛋白基因敲除小鼠模型）的红细胞在程序性死亡过程中力学及流变学参数、锚蛋白和磷脂酰丝氨酸的外翻信号进行了检测,对膜蛋白之间的相互作用及巨噬细胞对不同膜蛋白缺失的红细胞识别能力的差异进行了研究。结果显示,在红细胞程序性死亡过程中,带4.2蛋白和原肌球调节蛋白基因敲除小鼠模型红细胞的变形能力受到的影响最大,也就是说,这两种膜蛋白缺失后的红细胞膜骨架结构的稳定性相对最差。与正常红细胞相比,带3蛋白和锚蛋白基因敲除小鼠模型的红细胞的力学及流变学特性也受到一定的影响。然而,锚蛋白基因敲除小鼠模型的红细胞中,缺乏调节区域的锚蛋白外翻比例最高;带3蛋白基因敲除小鼠模型的锚蛋白外翻比例相对最低。这个研究结果表明,锚蛋白调节区域部分或全部被切除可能更有利于其外翻,带3蛋白和锚蛋白的连接对锚蛋白的外翻有至关重要的作用。综上所述,本学位论文研究首次发现了在体外模拟红细胞程序性死亡的过程中,膜内在蛋白——锚蛋白在钙离子和流体剪切力的作用下会暴露在细胞膜的表面,且可以被巨噬细胞受体分子——整合素α_vβ₃识别。锚蛋白和整合素α_vβ₃介导的衰老红细胞和巨噬细胞之间的粘附可能是一个新发现的衰老或疾病红细胞识别机制。根据研究人员已发表的文献及本论文的研究结果,我们推测锚蛋白的外翻步骤如下:1)剪切力作用造成细胞外钙离子的大量涌入和红细胞膜结构的囊泡化,刺激细胞膜的不规则性,红细胞程序性死亡被触发;2)细胞内的钙离子浓度达到约10μM时会激活钙调节蛋白酶和其他一些依赖钙离子存在的酶类;3)钙调节蛋白首先水解锚蛋白,将锚蛋白的调节区域C末端切去约20 kDa,导致锚蛋白和带3蛋白、血影蛋白的结合力减弱80%;4)红细胞在血管中穿行不断的遭受流体剪切力的作用,而被部分水解的锚蛋白和其他膜蛋白的结合力减弱,部分锚蛋白在24个弹簧结构的作用下被弹出磷脂双分子层,RGD序列暴露在膜表面,从而介导巨噬细胞和衰老或疾病红细胞的粘附。迄今为止,研究人员对红细胞的成熟过程已有比较全面的了解,但红细胞死亡的过程还有待进一步分析。研究红细胞膜蛋白在红细胞程序性死亡过程中的作用可以为我们更深入全面的了解红细胞的基本生理情况和人工红细胞研究提供更有利的理论支持。