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树突状细胞(Dendritic cells,DC)不仅是最强的抗原递呈细胞(antigenpresenting cells,APC),而且其本身还具有调节免疫反应强度、诱导免疫耐受的作用。机体是一个有机复杂的系统,各组分在各层面上相互作用共同维持机体内环境的稳态,免疫系统亦是如此。研究证实在脾脏、肝脏微环境都可诱导DC及造血前体细胞(hematopoietic stem cells,HSC)进一步增殖分化为具有免疫负向调控功能的调节性树突状细胞(regulatoryDC,Dcreg),并对其微环境中的各细胞、趋化因子对DC的影响机制做了阐述。我们前期研究发现,成熟树突状细胞(mature dendritic cells,mDC)在肺脏基质微环境中可被诱导分化发育为特殊表型的Dcreg,且具有较弱的激活T细胞的能力,一定程度上可以降低免疫反应强度诱导免疫耐受,但是Dcreg的具体诱导机制尚未明确。肺脏基质微环境由多种功能性支架细胞、趋化因子与细胞因子(VEGF,TGF-β,GM-CSF和PGE2等)等组成,它们是协调肺脏局部产生先天性免疫应答和获得性免疫应答的主要信息传递者,具有极其广泛的生物学活性;那么肺脏基质微环境的各细胞因子在Dcreg的诱导分化过程中发挥了怎样的作用呢?在本项研究中,我们通过实验证实作为肺脏基质微环境中重要的细胞因子-血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通过影响树突状细胞的表型CD86与NO的分泌表达参与了肺脏基质微环境对免疫细胞的诱导分化过程与肺脏免疫稳态维持。
研究目的:
建立稳定的小鼠肺脏基质细胞系(murine pulmonary stmoral cells,MPSC),观察小鼠肺脏基质细胞分泌的细胞因子VEGF对成熟树突状细胞(mature dendritic cells,mDC)分化发育影响,并进一步探讨其对树突状细胞诱导免疫耐受的影响。
方法:
通过小鼠肺脏组织细胞的原代培养建立稳定的成纤维样基质细胞系,并从细胞形态及特异性蛋白表达两方面给予鉴定,结论为原代培养的肺脏基质细胞具备成纤维样细胞的特点,可以模拟肺脏局部微环境;采用RT-PCR方法检测肺脏成纤维样基质细胞分泌的细胞因子:血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),转化生长因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β),粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor,GM-CSF),白介素10(IL-10)的表达水平。建立肺脏基质细胞培养上清液/树突状细胞(细胞浓度2×106)共培养体系作为对照组,向体系中加入含有浓度为(5μg/ml)的VEGF中和性抗体作为试验组,各自细胞培养一周。通过特异性夹心酶联免疫法(ELISA)检测两组细胞培养上清中细胞因子(IL-10和IL-12p70)的含量,流式细胞术检测DC细胞表型(CD86,CD11c,Ia)表达水平,Griess试剂检测体系中NO的分泌量,CCK-8法检测树突状细胞诱导同种异体T细胞的增殖能力,两组结果进行比较。
结果:
VEGF中和抗体添加组诱导的DC与未添加抗体组Dcreg相比较其表面细胞因子IL-10、IL-12p70表达差别无统计学意义(P＞0.05),同样两组细胞诱导的T细胞增殖率无明显差别(P＞0.05);VEGF中和抗体添加组诱导的DC其细胞表型CD86表达与未添加抗体组Dcreg相比明显上调(P＜0.05),而NO的表达却明显低于未添加抗体组Dcreg(P＜0.05)。
结论:
我们通过细胞原代培养的的方法建立了稳定的肺脏基质细胞系;证明成熟树突状细胞并非终末细胞,它可以在肺脏基质微环境中分化发育DC新亚群-调节性树突状细胞(Dcreg);肺脏基质细胞分泌的VEGF通过下调细胞表面共刺激分子CD86的表达与调节NO的分泌水平参与了Dcreg诱导免疫耐受的过程。