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苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）,是一种革兰氏阳性细菌,具有高度特异的杀虫活性。几十年的应用实践表明,Bt制剂及转Bt杀虫基因植物是最为有效的农业害虫生物防治手段之一。稻飞虱一直以来都是危害水稻的重要害虫,经常性爆发成灾,给水稻的安全生产构成严重威胁,而且生产上对稻飞虱的防控主要依赖化学农药,致使稻飞虱的抗药性增强而再猖獗危害,同时导致严重的环境污染和食品安全问题。为此,如何实现稻飞虱的高效绿色防控是一个亟待解决的热点问题和应用型难题。但是,迄今对稻飞虱有高杀虫活性的Bt基因资源的发掘仍是空白,严重阻碍了Bt杀虫谱的拓展与大面积推广应用。本论文从建立标准生测体系和广泛筛选、鉴定批量Bt菌株对稻飞虱的杀虫活性入手,成功获得一株对灰飞虱（Laodelphax striatellus,small brown planthopper,SBPH）有高效杀虫活性的B t菌株,并进行了新杀虫活性基因的挖掘与功能验证。1.筛选对灰飞虱有杀虫活性的Bt菌株改良传统的稻飞虱生测方法。灰飞虱对湿度反应比较敏感,因北方空气干燥,即使在恒温恒湿光照培养箱中,湿度控制也不能满足灰飞虱生测需要,对照组死亡率常达到20%以上。改进后的生测系统采用透明塑料瓶,瓶底加入2%琼脂糖凝胶,保证了良好的湿度环境。经过改良后的生测体系,对照组死亡率可以控制在10%以下。而且,此装置瓶身、瓶盖可分离,更利于更换饲料,方便大批量操作,为杀虫基因的高通量筛选奠定了坚实基础。高杀虫活性菌株筛选。以改良后的生测体系为基础,利用添加了Bt晶体蛋白的人工饲料饲喂灰飞虱,测定了来自中国农业科学院植物保护研究所生物技术组保存的68株候选Bt菌株对灰飞虱的杀虫活性。成功获得一株对灰飞虱有高毒力（校正死亡率大于90%）的Bt菌株（IPPBI0TSUC1012）。2.挖掘、鉴定对灰飞虱有杀虫活性的Bt新基因杀虫蛋白的纯化与活性测定。从IPPBI0TSUC1012菌株提取的Bt蛋白样品经过凝胶过滤层析分离,将不同时间出峰的蛋白样品分别进行杀虫活性的测定,同时利用SDS-PAGE检测蛋白质条带。联合样品中蛋白浓度（通过凝胶条带的灰度值进行量化）及杀虫活性的大小（试虫校正死亡率）进行相关分析,明确了2条与杀虫活性高度相关的蛋白条带（r=0.83）,1条与杀虫活性中度相关的蛋白条带（r=0.66）。Bt基因组测序与新基因挖掘。利用454及illumina测序平台对IPPBI0TSUC1012菌株基因组进行测序,拼接后得到大小5.51 M的基因组草图,共39个Scaffold。基因组序列经过GeneMark.hmm PROKARYOTIC的预测一共预测到6063个蛋白质编码基因。上述基因经过Uniport数据库的注释以后,产生5846条注释结果,绝大多数（96.4%）预测到的蛋白质编码基因有注释信息。利用关键词“Cry,Cyt及VIP”对注释结果进行检索,只有“Cry”返回两条检索数据,分别为Translation5511312..5512181（direct）,290amino acids;Translation5512497..5513384（direct）,296 amino acids,并且对应同一条注释信息,在Uniport数据库中此序列的Primary accession number为D4QGQ7（Cry64Aa1）。将基因组中预测的蛋白质编码序列,构建成为Mascot本地数据库,进行质谱结果的检索,上述两条与杀虫活性高度相关的蛋白条带,分别匹配基因组里注释信息为D4QGQ7的两条蛋白序列,分别命名为Small Brown Plant Hopper Toxin-1和Small Brown Plant Hopper Toxin-2,简称ST-1、ST-2。ST-1和ST-2两个蛋白氨基酸序列之间具有51%的序列相似性。ST-2序列和Cry64Aa1、Cry33Aa1、Cry15Aa分别有45%、36%和31%的序列相似性。3.高活性Bt新基因的功能验证ST-1和ST-2两个基因的异源原核表达、纯化与活性测定。利用pHT-1A载体,构建3个重组质粒,两个质粒分别包含ST-1、ST-2两个基因,一个质粒同时连入两个基因进行共表达。质粒最终通过电击转化到Bt无晶体突变株HD73-,单独存在的ST-1、ST-2基因并不表达,但两个基因共表达成功。利用共表达的粗蛋白进行生测（浓度分别为5.27和5.13μg/mL）,持续6d灰飞虱校正死亡率为90%。对提取的粗蛋白,先后经过凝胶过滤层析及离子交换进行纯化,纯化后的蛋白浓缩,透析脱盐后对灰飞虱及白背飞虱（Sogatella furcifera）进行杀虫活性测定表明,两蛋白对两种试虫都表现出较高的杀虫活性,对灰飞虱的毒力回归方程式为y=3.67x+3.62,对白背飞虱的毒力回归方程为y=3.95x+2.99。利用SPSS Probit回归计算LC50分别为3.15μg/g、2.14μg/g,95%置信区间分别为2.12-3.80μg/g、1.18-2.57μg/g。ST-1和ST-2在已知的Bt蛋白对半翅目昆虫的活性研究中,仅次于Vip1/Vip2二元毒素,而对稻飞虱是目前发现的活性最高的Bt杀虫蛋白。ST-1和ST-2在浓度为300μg/g时,对鳞翅目二化螟（Chilo suppressalis）、小菜蛾（Plutella xylostella）、鞘翅目大猿叶甲（Colaphellus bowringi）均无杀虫活性,说明蛋白的杀虫活性具有高度特异性。研究表明,ST-1和ST-2同时包含ETX-MTX2结构域,据文献报道,ETX-MTX2蛋白家族,以及Toxin10家族的蛋白可能同时含有aerolysin中类似的β折叠结构,基于类似的结构特点,推断它们可能具有共同的成孔毒素的特性,而且对半翅目昆虫会有杀虫活性。研究结果填补了Bt蛋白对稻飞虱无高效杀虫活性的空白,拓展了Bt蛋白杀虫谱,将有望革新对半翅目害虫的防治手段,也为稻飞虱的绿色防控开辟了新途径。4.基于中肠转录组的Bt受体及相关功能基因分析灰飞虱中肠转录组测序与分析。灰飞虱中肠转录组经过去除低质量reads,最后一共产生26,404,470条平均长度90 bp的clean reads,经过Trinity拼接后一共产生了31,435条scaffold,其中15792条（50%）同NCBI已知蛋白序列有显著的相似性(E-value<10-5)并提交NCBI SRA数据库accession number为SRX274939。对注释后的基因进行GO及COG分析,同时比较了灰飞虱全虫转录组,将表达量显著高于全虫的灰飞虱中肠基因挑出,进行GO分析发现分子功能中有两类蛋白“Binding”和“Catalytic activity”有最多的分类数量,反映了中肠的生理功能,对食物的消化与转运,结合及催化活性有密切联系。同时,在转录组中发现了Bt蛋白的常见受体,如Aminopeptidase N（APN）,Alkaline phosphatase（ALP）,Cadherin（CAD）等。研究结果为进一步筛选对灰飞虱有杀虫活性的Bt新基因及受体基因,并明确其作用机理奠定了分子生物学基础。鱼尼丁受体基因（Ryanodine receptor,RyR）挖掘。利用灰飞虱、烟粉虱（Bemisia tabaci）,二化螟,小菜蛾和稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）5种农业昆虫的转录组数据进行RyR受体基因挖掘。通过RyR片段定位信息,设计引物扩增基因片段,利用Rapid-amplification of cDNA ends（RACE）技术获得末端片段序列,拼接所有获得的序列成为全长基因。5个物种中获得3条基因全长,1个完整的开放阅读框序列,1个半长序列。经过Northern Blot验证了序列存在于mRNA转录本。对本研究获得的RyR基因进行了序列分析,克隆的基因序列包括了RyR基因的2个EF-Hand,6个跨膜区域,最终在羧基端成孔序列的附近发现了N4968、N4970、N4981、S5004、L5027、N5059和R5076,这7个鳞翅目害虫专有位点。鉴于二酰胺类农药对鳞翅目昆虫有着高毒力,而且RyR基因作为其作用靶标,有理由认为这7个鳞翅目特异性位点与二酰胺杀虫剂的杀虫特异性有直接关系,RyR序列的克隆对稻飞虱的抗药性治理也是一个有序的推进。RyR受体基因的成功挖掘将为后续在利用灰飞虱中肠转录组数据挖掘Bt受体基因提供有益借鉴和技术支撑。