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L-叔亮氨酸是一种重要的手性非天然氨基酸,是合成许多抗肿瘤试剂、HIV蛋白酶抑制剂等药物的关键中间体,并广泛应用于饲料、食品、化妆品、农业和化工等领域。酶法催化前手性酮酸氨化还原生成非天然氨基酸,由于可完全生成光学纯产物,转化率很高及反应条件温和等优点,已经成为获取非天然手性氨基酸的重要途径之一。本课题通过基因组数据发掘的方法,共筛选出13个对三甲基丙酮酸(TMP)有活力的亮氨酸脱氢酶,其中性能最好的是来源于菌株Exiguobacterium sibiricum的NADH依赖型亮氨酸脱氢酶EsLeuDH。对此酶进行了纯化,并对其酶学性质进行了研究,其最适反应温度为45℃,最适反应pH为9.5；该酶的热稳定性很好,30℃半衰期433.2h,甚至60℃高温下半衰期长达3.1h,但同时特别值得指出的是,当温度低至0℃时,该酶仍有相当高的活力,比活3.8U-mg-1。该酶对其天然底物L-亮氨酸的Km为0.8mM,相应的Vmax为20.0μmol·min-1·mg-1,而对TMP的Km为16.8mM,相应Vmax为200.0μmol·min-1·mg-1,说明TMP也是该酶较适合的一个底物。与已报道的酶相比,LeuDH的底物谱也非常广泛,对大部分脂肪族酮酸都表现出较好的催化活力,但不同的是发现该酶对部分芳香族酮酸也有较高活力,如苯甲酰甲酸,邻氯苯甲酰甲酸等。本研究对高浓度(600mM)的TMP进行了酶促氨化还原反应,并进行了升级规模的反应。在1L反应体系和1.5倍底物当量的葡萄糖存在条件下,不添加任何辅酶,加入78.08g TMP和10g DCW·L-1的共表达重组冻干细胞,反应5.5h后转化率可达99%,ee值可达99%以上,结晶得到62.92g产物,比旋光度值为30.7。,纯度可达99%(HPLC纯),分离得率为80.0%,总转换数(TTN)为55,200,且操作稳定性好,反应24h后EsLeuDH残余活力仍有46%。上述实验结果表明,EsLeuDH在L-叔亮氨酸酶法合成中具有良好的工业应用潜力。