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前人通过基因定位发现两份水稻低植酸(low phytic acid, lpa)的Os02g0819400基因发生了突变,因此又将该基因定名为OsLpa1,但是迄今尚未通过互补试验在水稻中验证其功能,也尚未在水稻和其它生物中对该基因或其同源基因的分子生物学特征进行研究。已知OsLpa1基因至少存在三种剪切方式,但对不同转录本在不同组织和发育时期是否存在差异性表达及各自的功能也未见报道。为明确OsLpa1及其同源基因的生物学特征和功能,本研究对OsLpa1的表达特性和不同转录本在植酸合成中发挥的功能进行了初步研究。主要研究结果如下: (1) OsLpa1表达的组织特异性。通过构建启动子驱动GUS基因表达载体pOsLpa1-GUS,转化水稻愈伤组织获得54个植株,经GUS染色和PCR检测,共得到38个转基因阳性单株。对转基因阳性单株的不同组织部位的GUS显色表明:在根中,起支撑保护作用的根冠中无显色,根冠上方的分生区组织显蓝色,部分根毛也显蓝色;在茎和叶(主要是叶脉)中都可以观察到GUS显色。因植株尚未开花,花器官及种子中的表达情况将进一步补充。 (2) OsLpa1蛋白的亚细胞定位。将CaMV35S启动子驱动的OsLpa1的三个转录本与GFP构建融合表达载体,采用瞬时转化水稻原生质体和共聚焦显微观察,明确了OsLpa1的三个转录本编码的蛋白产物均定位在叶绿体中。 (3) OsLpa1的三个转录本在水稻不同时期不同组织部位的相对丰度。采用定量RT-PCR对OsLpa1的三种不同转录本相对丰度的时空表达特异性进行分析。结果表明:在萌发种子以及根和叶中均未检测到OsLpa1.3转录本,OsLpa1.2丰度显著高于OsLpa1.1,在根和叶中前者分别为后者的5.1倍和6.1倍。随着幼苗的生长,三种转录本的丰度均显著提高,在生长11天的幼苗中,OsLpa1.3转录本丰度最低,叶片中仅为OsLpa1.1和OsLpa1.2转录本丰度的10.2%和5.3%,根中为10.8%和6.1%。进一步生长后,在成熟期茎中Os Lpa1.1转录本的丰度已经超过了OsLpa1.2转录本,前者为后者的2.1倍。在发育种子中,OsLpa1.1的相对表达量显著高于OsLpa1.2和OsLpa1.3,Os Lpa1.1和OsLpa1.2转录本丰度均有一个上升和下降的过程,但OsLpa1.1转录本上升幅度更大,且在整个过程中相对表达量最高,在开花后21天种子中,OsLpa1.1转录本是OsLpa1.2转录本的13.4倍。 (4)不同转录本种子特异性沉默降低植酸含量的效果。为明确是否可通过RNAi下调OsLpa1基因表达来降低稻米种子植酸含量,本实验对采用种子特异性表达启动子Ole18(18Kda油体蛋白基因)结合发夹RNA(hpRNAi)和人工微小RNA(amiRNA)基因沉默表达载体转化水稻获得的一批低植酸转基因水稻材料进行分子检测获得转基因纯合植株,并分析其种子无机磷和植酸含量变化。通过对T2代种子进行GUS染色和PCR检测,在amiRNA和hpRNA转基因株系中分别筛选出48个和13个含有纯合转基因单株及其纯合野生型姐妹单株的株系。结果表明:与野生型相比,转基因植株植酸含量显著下降。采用发夹RNA干扰OsLpa1转录本OsLpa1.1可使糙米植酸含量下降18.4%-27.4%;采用人工微小RNA干扰OsLpa1转录本OsLpa1.2和OsLpa1.3可使糙米植酸含量下17.5%-21.8%。由此可见,水稻OsLpa1的不同转录本都可能在植酸合成中发挥作用。