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脂肪酸作为重要的生物能源,其合成反应的体外构建具有较大的应用前景。细菌的脂肪酸合成酶属于Ⅱ型脂肪酸合成酶系,包括FabA、FabB、FabD、FabF、FabG、FabH、FabI、FabZ、TesA、ACP十个单体蛋白分子,构成了起始缩合、碳链延伸、水解释放三个主要反应阶段。目前已有报道在适宜的条件下体外表达,并在液相体系构建的FAS反应系统能够稳定地合成长链饱和脂肪酸,具有较高的应用潜力。然而体外游离态脂肪酸合成酶系统面临产物及酶分子难以分离、FAS难以循环再利用、产物组分复杂等缺陷,如能将脂肪酸合成酶实现固定化将有效解决这些问题,提高反应应用潜力。 固定化酶是指可溶的游离酶分子通过某种方法被固定于某种特定基质材料上,往往利于从反应体系分离并重复利用、提高稳定性并易于操作等,从而赋予其更佳的性质和应用优势。然而传统的手段基于共价连接、极性吸附、包被、交联等方法,常常使得酶分子活性极大地损失。因而,选用良好的基质材料,如纳米纤维、纳米颗粒等应用于固定化酶,采用简便的固定化方式是十分必要的。 淀粉样纤维是蛋白或多肽自发组装形成的一种高度有序的纤维状聚集体,作为一种由蛋白自发组装形成的有序聚集体,具有良好的稳定性和形态多样性,体现出良好的生物纳米材料特性。其中酵母prion蛋白Ure2因其形成淀粉样纤维的N端结构域和C端功能性结构域的相对独立性,利用其N端形成的淀粉样纤维作为纳米骨架,实现活性酶分子乃至生物体代谢反应链在淀粉纤维表面的高效固定化展示,对于代谢生理研究以及体外生物酶工程反应器构建均具有重要意义。 微凝胶作为一种微米尺寸的三维网状凝胶颗粒,因其良好的结构稳定性可以被制备成微型生物反应器,具有独特而重要的应用价值。利用生物体内天然存在的酶分子体外制备微凝胶能够更好地模拟生物体条件,从而获得具有生物活性的微粒,是固定化酶在生物材料方面应用的手段之一。 本课题以淀粉样纤维Ure2作为骨架,将大肠杆菌FAS与Ure2的成纤维核心结构域PrD融合表达,获得了性质稳定的体外长链饱和脂肪酸合成固定化酶系统,同时通过构建微型反应柱结合其固定化酶性质对循环利用、反应可控及酶分子空间整合等方面进行了探究,并结合微流控技术尝试制备了一批微米尺寸的固定化脂肪酸合成酶微凝胶,展示了这固定化酶系统在纳米材料生物学方面的潜在应用价值。