【摘 要】
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背景:甲基苯丙胺（Methamphetamine,METH）是我国最主要的非法滥用物质,长期使用会导致强迫性觅药行为并诱发精神及认知障碍,但由于大脑细胞类型、连接及相互作用的复杂性,其机制尚不明确。单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA sequence,sn-RNA seq）是一种对大量单个细胞转录组进行分析的方法,它被应用于识别大脑各区域不同细胞亚型、探明细胞特异性标记物、揭
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背景:甲基苯丙胺（Methamphetamine,METH）是我国最主要的非法滥用物质,长期使用会导致强迫性觅药行为并诱发精神及认知障碍,但由于大脑细胞类型、连接及相互作用的复杂性,其机制尚不明确。单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA sequence,sn-RNA seq）是一种对大量单个细胞转录组进行分析的方法,它被应用于识别大脑各区域不同细胞亚型、探明细胞特异性标记物、揭示参与不同神经系统疾病的特定细胞类型及其功能。已有研究者将这项技术用于探讨动物吗啡和可卡因等成瘾性药物处理后特定脑区不同类型细胞的转录及功能变化,试图明确特定细胞亚型在药物成瘾及其诱导的认知和精神障碍中的作用。慢性METH处理能够导致前额叶皮质（PFC）结构受损、基因转录异常并促进成瘾中的神经适应,加剧METH使用障碍的形成,但PFC中不同类型细胞的转录变化及如何参与METH成瘾和使用障碍尚不明确。目的:探究甲基苯丙胺慢性给药对小鼠前额叶皮质不同类型细胞的基因转录的影响,为探明甲基苯丙胺成瘾及其诱导的认知和精神障碍的机制提供线索。方法:腹腔注射甲基苯丙胺（5mg/kg/d）14天建立小鼠慢性给药模型,前额叶皮质匀浆,碘克沙醇梯度溶液分离获取单细胞核,Illumina Hiseq平台2×150 bp双端测序模式高通量测序检测基因表达,将基因表达数目位于200到6000间且线粒体与细胞核基因UMI序列数比值小于20%的细胞纳入研究,基于单个细胞中平均表达量和标准方差挑选差异基因,依据差异基因表达使用PCA法计算细胞之间相似性,UMAP非线性降维分析进行细胞聚类并评价给药所造成各聚类转录组变化,通过前额叶皮质各类型细胞特异性基因表达分析各聚类所属细胞类型,选取给药前后转录组变化明显的聚类进行差异性基因分析以揭示其转录特征,GO和KEGG富集通路分析评价给药造成特定聚类功能改变。通过透射电镜观察髓鞘及其中线粒体形态。结果:本研究共纳入20698个单细胞核RNA测序结果（METH组9876个,对照组10822个）,PCA和UMAP降维分析将细胞分为33个聚类,包括六种主要的细胞类型,即神经元（Rbfox3+）（Cluster 1,3,5-13,15-18,21-25）、星形胶质细胞（Gja1+）（Cluster 20）、小胶质细胞（Cx3cr1+）（Cluster 4）、成熟少突胶质细胞（Mog+）（Cluster 0,2）、少突胶质前体细胞（Pdgfra+）（Cluster 19）和新生少突胶质细胞（Bmp4+）（Cluster 28）。其中神经元可进一步分为兴奋性神经元（Neurod6+/Slc17a7+/Nrn1+）（Cluster 1,3,5,8,9,11,13,17,18,21,23,24）和抑制性神经元（Gad1+/Gad2+/Slc32a1+）（Cluster 6,7,10,12,15,16,22）两种主要亚型,兴奋性神经元依据所在皮质的不同部位分为L2/3（Cux2+）,L4（Rorb+）,L5（Etv1+）,L6a（Foxp2+）和L6b（Ctgf+）神经元;抑制性神经元分为来源于内侧神经节隆起的Sst+神经元和尾神经节隆起的Vip+神经元。其中给予甲基苯丙胺处理组的小鼠与对照组相比,Cx3cr1+小胶质细胞和Mog+成熟少突胶质细胞转录水平显著变化。GO分析发现少突胶质细胞的差异基因富集在与ATP代谢过程、细胞色素c氧化酶活性、ATP酶偶联离子跨膜转运活性、ATP酶活性、线粒体膜成分及髓鞘形成等相关通路;小胶质细胞的炎性相关基因上调,且差异基因富集在G蛋白偶联受体结合、泛素连接酶结合、阳离子转运等相关通路。KEGG分析结果表明二者差异基因与亨廷顿舞蹈症、阿尔兹海默症和帕金森氏病等神经退行性疾病相关通路有关。透射电镜结果提示甲基苯丙胺慢性处理小鼠髓鞘受损,成熟少突胶质细胞和髓鞘中的线粒体形态异常改变,出现肿胀、嵴崩解。结论:甲基苯丙胺慢性处理小鼠前额叶皮质成熟少突胶质细胞和小胶质细胞的基因转录发生较大变化,提示其在甲基苯丙胺诱导的认知和精神障碍中可能起重要作用。
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