背景:角膜上皮细胞的更新来源于角膜上皮干细胞，目前研究显示角膜上皮干细胞主要存在于角膜缘部位，又称角膜缘干细胞。临床上由于严重的化学烧伤、热烧伤、电离辐射、严重炎症、Stevens Johnson综合征等，可以导致角膜缘干细胞缺乏或功能障碍，引起视力下降甚至丧失，治疗尤为棘手。随着组织工程技术的飞速发展，体外分离及培养人角膜上皮干细胞，用于角膜缘上皮片的构建，通过临床移植进行眼表重建，成为非常有应用前景的治疗手段。　　对于角膜上皮干细胞的体外培养，国内外研究学者多采用SHEM(supplemental hormonal epithelial medium)培养液进行角膜上皮干细胞的培养，但SHEM培养液中含有一定量的胎牛血清，容易促进角膜上皮干细胞的分化，且胎牛血清中动物源性成分复杂，不利于研究成果的临床转化。面对体外培养的干细胞另一难题就是分离，国内外文献中报道的分离技术有免疫磁珠分离技术、流式细胞术等，但免疫磁珠分离技术价格昂贵，不利于广泛开展;流式细胞术需要标记细胞，且不易无菌操作，都存在一定弊端。　　体外构建人角膜缘上皮片的方法也有多种，国内外文献中报道较多的方法是气液界面，但是该方法多在SHEM培养体系下完成;文献报道中研究比较热的培养方法是3D培养法，但是构建细胞外支架的基质多是鼠源性的，价格昂贵，构建的上皮片在眼科临床上并没有广泛应用。　　第一部分:活体及离体条件下对角膜上皮干细胞的定位研究　　目的:本研究通过活体激光扫描角膜共焦显微镜及免疫荧光染色技术对角膜上皮干细胞进行定位研究，为角膜上皮干细胞的体外培养提供取材范围指导。　　方法:收集2009年9月～2012年9月来河南省眼科研究所就诊的单侧角膜缘干细胞缺乏患者，使用活体激光扫描角膜共焦显微镜检查患者双眼，健侧眼为对照。扫描方位依次为中央角膜及上、下、左、右方的角膜缘，记录角膜及角膜缘上皮各层、前弹力层的扫描图像，对检查资料进行研究和统计学分析。眼球材料来自于河南省眼库，切取角膜中央和角膜缘组织，组织包埋剂包被、切片，切片厚度5～7μm;免疫荧光染色技术检测p63、ABCG2、CK19、CD29、K3、Connexin43和involucrin在角膜中央及角膜缘上皮层的表达，激光扫描共焦显微镜观察拍照并记录分析。由内向外将角膜缘上皮层三等分，实时荧光定量PCR检测不同部位的角膜缘上皮层中p63、ABCG2及K3的mRNA表达，采用2-ΔΔCT法进行相对定量分析。　　结果:共有24位患者确诊为单侧角膜缘干细胞缺乏，男19例，（36.00±12.24）岁，女5例，（38.60±5.41）岁。健侧眼在活体激光扫描角膜共焦显微镜下的表现:角膜中央各层细胞形态清晰可见，前弹力层可见平行走行的神经纤维;角膜缘上皮层中可见Vogt栅栏、栅栏间形成钉突结构及伴行的色素细胞。患侧眼示角膜中央典型的上皮细胞形态消失，结膜化的角膜区域出现结膜上皮细胞、杯状细胞以及角膜新生血管;前弹力层平行走行的神经纤维消失，上皮层下可见树突状细胞;角膜缘区域Vogt栅栏状结构消失，色素细胞消失，取而代之的是大量纤维瘢痕化组织。免疫荧光染色示表达ABCG2和p63的细胞主要在角膜缘上皮基底层，尤其在近结膜侧的角膜缘及角膜缘中间部表达相对较高，而中央角膜上皮层细胞不表达;CK19及CD29在角膜缘上皮基底层的表达强于基底层以上的上皮细胞，在中央角膜上皮全层也有大量表达;K3、Connexin43及Involucrin在角膜缘上皮基底细胞层不表达，中央角膜上皮全层表达。Real-timePCR检测示p63及ABCG2mRNA的表达主要集中在近结膜侧的角膜缘及角膜缘中间部的上皮层。　　小结:细胞分子蛋白检测提示角膜上皮干细胞主要存在于近结膜侧的角膜缘及角膜缘中间部的上皮基底层，这与活体激光扫描角膜共焦显微镜观察到干细胞存在的微环境-钉突分布是一致的。　　第二部分:微孔滤网联合水浴处理的羊膜体外分离人角膜上皮干细胞　　目的:探索利用无血清培养技术进行角膜缘上皮干细胞的体外扩充培养，以及对培养的上皮干细胞采用微孔滤网联合水浴处理的羊膜粘附进行体外分离。　　方法:角膜缘组织来自直径小于8mm的穿透角膜移植术后的供体眼球材料，解剖显微镜下剖取角膜缘上皮层外2/3区域，浸泡于K-SFM(Keratinocyte-serum freemedium)培养液中，37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育12小时。组织块以上皮面向下贴壁，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，12h后换液，以后隔日换液。每天于相差显微镜下观察细胞生长变化，记录拍照。组织块周边有细胞游离出贴壁生长记作“培养第1天”，分别取培养第5、10、14天的原代培养细胞为标本，免疫荧光染色检测K3、p63及ABCG2的表达。细胞融合面积达90％以上时，0.25％Trypsin/0.02％EDTA作用5mins，终止，离心收集细胞，制成细胞悬液，依次使用孔径40μm和30μm细胞滤网收集直径小于30μm的细胞。按照5×104/cm2的细胞密度接种于去上皮后60℃水浴处理的羊膜载体上，依据细胞贴壁时间不同，共分4组:5mins组、10mins组、20mins组及40mins组，达贴壁时间后，弃去未贴壁细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中过夜培养。免疫荧光染色技术检测4个时段贴壁细胞K3及p63的表达。选取4组中分离到角膜上皮干细胞相对较高组继续培养，隔日换液，每天于相差显微镜下观察细胞生长变化，记录拍照。免疫荧光染色技术检测膜片中第1、3、5、7、9天的p63及K3的表达，计算阳性细胞比例，采用冰冻切片技术和H-E染色技术观察细胞层数。　　结果:原代细胞的形态学观察:培养第5天，有大量细胞从组织块游离出贴壁生长，细胞增殖旺盛，部分细胞内可见到双核;细胞膜片上粘附有少量从组织块上脱落的细胞;培养第10天，细胞核清晰可见，细胞连接及终末分化细胞少见，膜片上小体积细胞较多，聚集成灶状分布;培养第14天，可见细胞克隆，克隆灶内细胞体积较小，形态均一。免疫荧光染色检测ABCG2、p63、K3在培养第5、10、14天原代细胞中的表达:培养第五天，K3表达量较多，p63有少量表达，未检测到ABCG2的表达;培养第十天，K3的表达量增多，p63表达量较培养第五天有明显增多，ABCG2也有少量表达;培养第十四天，表达ABCG2、p63及K3的阳性细胞比例分别为:(24.80±3.88)％、(39.46±4.74)％、(40.71±5.38)％。免疫荧光染色检测4组中贴壁细胞p63及K3的表达:细胞贴壁5mins组中贴壁细胞相对较少，表达p63及K3阳性细胞数低于10mins组，20mins组及40mins组(P＜0.05);细胞贴壁10mins组，20mins组及40mins组中贴壁细胞较多，20mins组和40mins组中表达p63的阳性细胞比例低于10mins组(P＜0.05)，贴壁10mins组中表达K3的阳性细胞比例低于20mins组和40mins(P＜0.05)。因此，10mins组中p63表达较高，而K3表达相对较低，应为细胞贴壁分选较好的时间点。贴壁10mins分离的细胞在水浴羊膜载体上继续培养，第3天形成单层膜片;随着培养时间的变化，p63的表达逐渐降低而K3的表达逐渐增高，不同时间点的切片显示在培养过程中细胞膜片为单层。　　小结:利用无血清培养技术成功进行了角膜上皮干细胞的体外扩增培养，并采用微孔滤网联合水浴处理的羊膜对人角膜上皮干细胞进行了成功分离。　　第三部分:无血清培养条件下人角膜缘多层细胞上皮片的体外构建　　目的:探索在该无血清培养条件下构建人角膜缘多层细胞上皮片的方法，维持构建上皮片中含有一定比例的角膜缘干细胞。　　方法:角膜缘干细胞的原代培养及分离方法同第二部分。构建多层细胞上皮片所采用的培养液为:DMEM/F12培养基与K-SFM培养液的混合液。为了检测两种培养液的合适混合比例，实验分为4组:对照组:K-SFM培养液;其余三组中DMEM/F12与K-SFM培养液的混合比例分别为:1∶9，3∶7，1∶1。每天于相差显微镜下观察细胞生长变化，记录拍照。分化至第七天，免疫荧光染色技术检测4组中p63及K3的表达;冰冻切片技术和H-E染色技术观察细胞层数;依据p63、K3表达的阳性细胞比例和分化的细胞层数判定两种培养液较好的混合比例。贴壁10mins分选到的细胞继续培养，待细胞生长达融合时更换分化培养液，记作分化第1天，每天于相差显微镜下观察细胞生长变化，记录拍照。免疫荧光染色技术检测分化第1、3、5、7天膜片中p63的表达，冰冻切片技术和H-E染色技术观察细胞层数。为了进一步检测构建上皮片的活性，将构建的上皮片贴壁于六孔板中培养，观察膜片周边能否有细胞游离出贴壁生长，每天于相差显微镜下观察细胞生长变化，记录拍照，免疫荧光染色技术检测p63表达。　　结果:检测两种培养液的合适混合比例，对照组及1∶9组中p63表达较高，K3表达相对较低，但二者在分化至第七天时细胞连接仍形成不完整，利用冰冻切片及H-E染色观察二者较多区域为单层细胞膜片;而1∶1组中冰冻切片及H-E染色观察膜片形成较厚，有3～4层细胞，相差显微镜观察可见形成均一的细胞连接，但1∶1组中p63表达明显低于其他三组(P＜0.05)，膜片部分区域过度分化，出现空洞;3∶7组中p63仍有相对较高的表达，相差显微镜观察也可见形成均一的细胞连接，未见过度分化形成的空洞，冰冻切片及H-E染色观察膜片形成较厚，有3～4层细胞。因此，3∶7比例的混合液是混合比例较好的分化培养液。分选后的细胞增殖融合，形成单层膜片时更换分化培养液，在分化培养第五天，细胞排列紧密，细胞间的紧密连接逐渐形成，此时形成的膜片有2～4层细胞;免疫荧光染色技术检测在第1、3、5天膜片中p63均有较高的表达，但在第1、3天，细胞膜片较薄，细胞连接形成不完整，因此在培养第五天前后的膜片较好。将构建的上皮片贴壁于六孔板中培养，观察膜片周边有细胞游离出贴壁生长，免疫荧光染色技术检测贴壁细胞中仍有较多的p63表达，上皮片活性良好。　　小结:通过混合培养液混合比例的对比，采用3∶7比例混合的DMEM/F12与K-SFM培养液成功构建了多层细胞的人角膜缘上皮片，并且上皮中含有较多的角膜缘干细胞。　　第四部分:移植体外构建人角膜缘多层细胞上皮片进行眼表重建　　目的:观察移植体外构建的人角膜缘多层细胞上皮片进行眼表重建的疗效。　　方法:收集2009年～2012年来河南省眼科研究所就诊的双侧角膜缘干细胞缺乏患者，使用结膜印迹细胞学对角膜缘干细胞缺乏患者进行诊断;对于结膜印记细胞学诊断阴性的患者使用活体激光扫描角膜共焦显微镜进行辅助诊断，检查患者双眼，扫描方位依次为中央角膜及上、下、左、右方的角膜缘，记录角膜及角膜缘上皮各层、前弹力层的扫描图像，对检查资料进行研究和统计学分析。采用免疫荧光染色技术及冰冻切片技术对移植前使用的角膜缘上皮片进行检测，观察p63的表达及上皮片的细胞层数。取得患者的知情同意，并签署知情同意书、手术协议书后对确诊的角膜缘干细胞缺乏患者进行体外构建的人角膜缘多层细胞上皮片的移植。术后局部应用抗生素滴眼液，预防感染;口服环孢霉素胶囊及局部应用FK506、激素类滴眼液进行抗排斥反应，每隔三个月抽血进行肝肾功能检测。患者复诊时间为术后1月、3月、6月及1年，以后每个一年复诊一次，复诊时记录视力、眼表裂隙灯检查及荧光素染色检查。　　结果:共有5位患者（6只眼）入组接受手术治疗，4男1女，平均年龄:(31.00±11.64)岁。采用结膜印迹细胞学对10只眼进行角膜缘干细胞缺乏诊断，6只眼结膜化区域查到有杯状细胞，PAS染色阳性。对另外4只行活体激光扫描角膜共焦显微镜检查:角膜中央典型的上皮细胞形态消失，结膜化区域可见结膜上皮细胞以及杯状细胞，结膜化后角膜新生血管，前弹力层神经纤维消失，上皮层下可见树突状细胞;角膜缘区域Vogt栅栏状结构消失，色素细胞消失，取而代之的是大量纤维瘢痕化组织，符合角膜缘干细胞缺乏的共焦显微镜表现。免疫荧光染色技术对每批移植用的上皮片检测表达p63的阳性细胞比例，每批均在10％以上，冰冻切片技术及H-E染色检测细胞层数为3～4层。在移植后的1年随访中，三眼经过移植治疗后未见有纤维血管膜及新生血管长入角膜，两眼角膜周边1/4象限区域有少量新生血管长入，另一眼角膜上有纤维血管膜长入，移植治疗取得了一定疗效。　　小结:通过构建的角膜缘多层细胞片移植可以治疗角膜缘干细胞缺乏，在一定时期内观察取得了成功的疗效。　　结论:　　1.通过活体激光扫描角膜共焦显微镜及免疫荧光染色技术显示角膜缘干细胞主要位于角膜缘外2/3区域的Vogt栅栏基底部及钉突结构中;　　2.利用无血清培养技术成功进行了角膜上皮干细胞的体外扩增培养，并采用微孔滤网联合水浴处理的羊膜成功对培养的人角膜上皮干细胞进行分离;　　3.采用3∶7比例混合的DMEM/F12与K-SFM培养液成功构建了多层细胞的人角膜缘上皮片并能维持上皮片中较多角膜缘干细胞的存在;　　4.通过构建的角膜缘多层细胞片移植可以治疗角膜缘干细胞缺乏，在一定时期内观察取得了成功的疗效。